GW4064对LPS诱导的RAW264.7细胞中炎症反应的影响①

李淑玲 郭明洲 仉子轩 李 闻

(中国人民解放军总医院，解放军医学院，北京 100853)

GW4064是一种已知的胆汁酸核法尼醇X受体(farnesoid X receptor，FXR)的小分子激动剂,FXR受体参与机体的代谢及炎症的调节。FXR不仅在肝脏、肠道和肾脏中表达，在免疫细胞中也同样发现了FXR的表达[1-3]。最新研究发现FXR可抑制NLRP3的激活从而调节NLRP3相关的炎症反应[4]。GW4064通过激活FXR可下调肝脏NF-κB信号的激活，进一步调控肝脏炎症的发生发展[5]。虽然目前有大量的研究显示FXR基因具有抗炎作用，但是对于FXR激动剂GW4064对LPS导致炎症反应的作用及机制有待深入研究；而巨噬细胞是参与炎症反应的主要免疫细胞，巨噬细胞在激活后可产生各种炎症介质。脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)是革兰氏阴性细菌细胞壁的一个组成部分，可激活巨噬细胞释放炎症介质，包括一氧化氮(NO)、炎症细胞因子(如IL-1β、TNF-α等)；而NO主要受活化巨噬细胞在炎症状态下iNOS过表达的影响而产生[6]。 因此，本研究主要探讨LPS刺激的RAW264.7巨噬细胞模型中GW4064对促炎因子的分泌和释放，iNOS表达和NO产生的影响，为GW4064在免疫细胞中的抗炎作用提供进一步的依据。

1 材料与方法

1.1材料 小鼠巨噬细胞RAW264.7细胞株购自北京协和细胞库；GW4064购自Selleck公司；胎牛血清(FBS，10099141)购自Gibco公司；DMEM培养基和双抗(青霉素+链霉素)购自Hyclone公司；二甲基亚砜(DMSO)购自Amresco公司；内毒素(LPS)购自Sigma公司；iNOS抗体、NF-κB抗体、β-actin抗体购自Abcam公司；p-NF-κB抗体购自CST公司；HRP标记山羊抗兔IgG(H+L)、HRP标记山羊抗小鼠IgG(H+L)购自碧云天生物技术有限公司；引物购自华大基因研究中心；逆转录试剂盒购自Invitrogen公司;SYBR Green Realtime PCR Master Mix购自ToYoBo公司；AimPlex流式高通量多因子购自旷博生物科技有限公司。

1.2方法

1.2.1细胞培养及GW4064溶解 RAW264.7细胞用含10% FBS、100 U/ml青霉素、100 U/ml链霉素的DMEM高糖培养基于37℃，5% CO2的细胞培养箱中培养，取对数生长期的细胞用于实验。用DMSO配成不同终浓度的GW4064溶液用于实验。

1.2.2促炎细胞因子的测定 将RAW264.7细胞按照5×105个/孔接种于6孔板中，分为对照组、LPS组、2 μmol/L GW4064+LPS组、4 μmol/L GW4064+LPS组、8 μmol/L GW4064+LPS组、16 μmol/L GW4064+LPS组。每组设置3个复孔。除对照组外，其余每孔用GW4064(0、2、4、8、16 μmol/L)预处理24 h,然后加入 1 μg/ml的LPS培养24 h。培养结束后，取细胞上清于热灭活的EP管中，4 000 r/min离心10 min后，收集细胞上清存于-80℃冰箱中，用于细胞因子的检测。用TRIzol提取RNA，定量后逆转录成cDNA。采用SYBR Green PCR试剂进行PCR产物的扩增和检测，以β-actin作为内参，采用2-ΔΔCt计算各因子的mRNA的相对表达量。

1.2.3细胞上清中NO的测定 将RAW264.7细胞按照5×105个/孔接种于48孔板中，分为对照组、LPS组、1 μmol/L GW4064+LPS组、10 μmol/L GW4064+LPS组、20 μmol/L GW4064+LPS组,每组设5个复孔。除对照组外，其余每组加入终浓度为0、1、10、20 μmol/L的GW4064预处理24 h,然后加入 1 μg/ml的LPS于细胞培养箱中孵育24 h。收集细胞上清，按照Griess试剂盒的操作步骤检测细胞上清中NO的量。

1.2.3细胞中iNOS和NF-κB蛋白的表达 采用Western blot技术检测iNOS和NF-κB蛋白的表达：将RAW264.7细胞按照5×105个/孔接种于6孔板中，设置2个复孔，LPS单独或与不同浓度的GW4064处理后，收集蛋白。用预冷的PBS清洗2遍，每孔加入300 μl含蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂的RIPA裂解液，冰上裂解30 min，4℃13 000 r/min 离心30 min，收集上清，按照BCA定量试剂盒的说明测定收集的蛋白浓度。用SDS-PAGE凝胶分离蛋白，然后转移至PVDF膜上，用5%的脱脂牛奶在室温下对PVDF膜封闭 1 h,4℃过夜，分别孵育iNOS(1∶250)抗体，NF-κB(1∶1 000)抗体，p-NF-κB(1∶1 000)抗体，β-actin(1∶2 000)抗体。PBST洗膜3次，每次10 min,在室温下孵育相对应的二抗1 h,PBST洗膜3次，每次10 min，然后进行曝光。使用Image J软件分析条带灰度值。

2 结果

2.1GW4064对LPS诱导的RAW264.7细胞炎症因子TNF-α、MCP-1分泌及IL-1β、TNF-α、iNOS基因表达的影响 与正常对照组相比，RAW264.7细胞受LPS刺激后，促炎因子IL-1β、TNF-α、iNOS的基因的表达显著上升，差异有统计学意义(P<0.05)。与模型组相比，给予GW4064(2、4、8、16 μmol/L)预处理后，IL-1β、TNF-α、iNOS mRNA的表达均明显降低，差异具有统计学意义(P<0.05)，见图1。同样，与正常组相比，LPS诱导的炎症模型组中，细胞上清中TNF-α、MCP-1因子的分泌显著上升，而给予GW4064处理后，可呈剂量依赖性地降低TNF-α、MCP-1的分泌，差异具有统计学意义，见图2。

2.2GW4064对LPS诱导的RAW264.7细胞NO释放的影响 与对照组相比，模型组RAW264.7细胞受LPS刺激后释放大量NO，差异具有统计学意义(P<0.01);用不同浓度GW4064预处理RAW264.7细胞释放NO的量均有不同程度降低，并呈剂量依赖性降低，差异具有统计学意义(P<0.05)； 实验表明，GW4064可抑制巨噬细胞中NO的释放。见图3。

图1 GW4064对LPS诱导的RAW264.7细胞炎症因子mRNA表达的影响Fig.1 Effects of GW4064 on mRNA expression of inflamm-atory factors in LPS-stimulated RAW264.7Note:Compared with LPS group，*.P<0.05，#.P<0.01.

图2 GW4064对LPS诱导的RAW264.7细胞上清中炎症因子TNF-α、MCP-1分泌的影响Fig.2 Effects of GW4064 on cell supernatant secretion of TNF-α,MCP-1 in LPS-stimulated RAW264.7Note:*.P<0.05，**.P<0.01.

图3 GW4064对LPS诱导的RAW264.7细胞释放NO的影响Fig.3 Effects of GW4064 on production of NO in LPS-stimulated RAW264.7Note:*.P<0.05,**.P<0.01.

2.3GW4064对LPS诱导的RAW264.7细胞iNOS及NF-κB蛋白表达的影响 Western blot 显示，GW4064 (10、20 μmol/L)可显著抑制LPS诱导的巨噬细胞iNOS的蛋白的表达(P<0.01)，虽然1 μmol/L 的GW4064降低了iNOS蛋白的表达，但是差异无统计学意义(P=0.062)，如图4所示。NF-κB磷酸化程度可以反映巨噬细胞中NF-κB激活的程度，通过Western blot对NF-κB磷酸化蛋白及总蛋白进行检测，结果显示不同浓度的GW4064均能抑制LPS诱导的巨噬细胞中NF-κB的磷酸化，如图5所示。

图4 GW4064对LPS诱导的RAW264.7细胞iNOS蛋白表达的影响Fig.4 Effects of GW4064 on expression of iNOS protein in LPS-stimulated RAW264.7Note:**.P<0.01.

图5 GW4064对LPS诱导的RAW264.7细胞p-NF-κB蛋白表达的影响Fig.5 Effects of GW4064 on expression of p-NF-κB protein in LPS-stimulated RAW264.7Note:**.P<0.01.

3 讨论

核受体是配体调节因子家族，其在代谢和免疫功能之间发挥稳态调节功能。胆汁酸核受体FXR是在免疫细胞如巨噬细胞中表达的胆汁酸传感器，FXR缺陷小鼠可出现免疫反应的失调。研究显示在巨噬细胞中，胆汁酸受体FXR和干扰素γ-STAT-1通路存在相互调节，参与炎症反应的调控[2]。一些研究表明，炎症因子LPS、TNF-α和IL-1β对FXR也发挥负调节作用，在炎症急性期，组织中FXR基因表达下调[7]。尽管FXR具有潜在的抗炎特性，但是对于FXR及激动剂GW4064在巨噬细胞中对炎症因子的调节及对NO、iNOS是否具有调节作用尚不明确。尽管炎症是免疫系统保持完整性和抵抗生理学威胁的基本防御机制，但是炎症的紊乱可导致各种疾病的发生发展，包括各种急性炎症和慢性炎症。本研究显示，GW4064可抑制LPS活化的巨噬细胞炎症介质IL-1β、TNF-α mRNA的表达，同时抑制细胞上清中炎症因子TNF-α、MCP-1分泌。而炎症因子作为早期炎症的标志物，在机体损伤、感染等情况大量分泌，促进炎症反应的发生，可进一步加重机体各组织的损伤。

NO作为细胞间信息传递的重要分子，可直接抑制细菌物种的生长，这种气体增加了由活化的中性粒细胞和巨噬细胞产生的H2O2的杀菌活性，参与机体的炎症和免疫反应[8]； LPS诱导的巨噬细胞可产生过量的NO导致细胞及组织的损伤，本研究显示GW4064可呈剂量依赖性的抑制受LPS激活的RAW264.7巨噬细胞中NO的产生。可见，GW4064可在一定程度上通过减少NO的释放，进而发挥其抗炎作用，而NO的过量产生主要是由iNOS的异常表达引起，iNOS的过度或异常表达与许多疾病过程的发病机理有关[9]。因此，抑制iNOS的表达有助于控制由iNOS导致的相关炎症性疾病[10]。NF-κB作为一种转录因子，与机体的炎症反应、免疫调节等密切相关[11,12]，炎症因子和iNOS的表达需要NF-κB的参与，而磷酸化是NF-κB基于激活的关键步骤。本研究发现，GW4064干预后，受LPS激活的巨噬细胞中的iNOS的mRNA及蛋白的表达呈剂量依赖性的下降，抑制了NO的生成，并且GW4064负调控LPS诱导的RAW264.7细胞中NF-κB磷酸化，这可能是减轻巨噬细胞炎症反应的主要原因和机制之一。

总之，GW4064具有潜在的抑制巨噬细胞炎症反应的作用，可以抑制炎症介质的产生，并负调控由LPS诱导的巨噬细胞iNOS和NF-κB的表达，这可能是FXR调控炎症反应的机制之一，有助于揭示GW4064在调控炎症性疾病中的潜在应用价值。