糖尿病大鼠骨髓干细胞和脂肪干细胞的生物学特性：对照研究

王蕾 陈旭涛 丁锋 王悦 宋应亮

糖尿病的高血糖毒性，异常胰岛素及细胞因子水平、氧化应激等，导致了以低骨量和骨组织微结构破坏为特征糖尿病性骨质疏松的形成[1-2]。同时，糖尿病患者骨折风险增加，骨折愈合能力显著降低[3]，糖尿病患者种植体的早期骨结合受到影响[4]。近年来，组织工程技术利用间充质干细胞自我更新，多向分化等优势，来提高糖尿病患者的成骨能力。自体干细胞由于临床易得及无免疫排斥的优点，成为理想的种子细胞。其中，BMSCs及ADSCs得到最广泛的应用[5-6]。但对于糖尿病患者，干细胞的生物性能有所改变[7-8]，选择最适宜的自体干细胞作为糖尿病患者骨再生的种子细胞也成为应用热点。本研究通过比较糖尿病大鼠来源的ADSCs和BMSCs基本生物学特性，以期为之后的相关研究提供指导。

1 材料与方法

1.1 主要试剂和仪器

MEM Alpha培养基(HyClone，美国)；胎牛血清(BI，以色列)；CCK-8试剂盒(南京恩晶生物科技有限公司)； 油红O(Sigma，美国)； 碱性磷酸酶(ALP)显色试剂盒(北京康为世纪生物科技有限公司)； 天狼猩红染色液、茜素红染色液，结晶紫染色液(Solaibio®， 北京索莱宝)；总RNA提取试剂盒(TIANGEN®, 天根生化科技(北京)有限公司)、反转录试剂盒、RT-PCR试剂盒(Takara，日本)；细胞孵箱(Thermo，美国)；显微镜(OLYMPUS，陕西华大生物公司)。

1.2 糖尿病模型建立

取10只SPF级8周龄SD雄性大鼠(第四军医大学实验动物中心提供)，适应性喂养1 周后，随机分为:糖尿病组(n=6)和正常对照组(n=4)。糖尿病组:高脂高糖饲料喂养4 周后，以30 mg/kg剂量的STZ行腹腔注射。 1 周后尾尖取血，测血糖，以随机血糖大于16.7 mmol/L为建模成功。正常对照组:普通饲料喂养，并在4 周时行等量柠檬酸缓冲液注射。

1.3 干细胞的分离及培养

ADSCs的分离及培养：选建模成功4 周后的糖尿病大鼠，过量麻药处死。无菌条件下取腹股沟处的脂肪组织，胶原酶消化法提取ADSCs， 37 ℃、 5% CO2细胞孵箱培养。之后每3 d换液至细胞汇合达80%时传代。

BMSCs的分离和培养：无菌条件取大鼠双侧下肢骨。注射器吸取完全培养基，深入骨髓腔内反复冲洗至其内发白，收集细胞悬液，离心重悬后接种， 37 ℃、 5% CO2细胞孵箱培养。之后每3 d换液1 次，至细胞汇合达80%进行传代。

1.4 细胞克隆及增殖活性检测

克隆形成率测定：将P3代细胞接种于100 mm培养皿，细胞数为1 000 个/皿。 10 d后多聚甲醛固定，0.1%的结晶紫染液染色15 min，显微镜下观察，计数并拍照。计算细胞克隆形成率。

CCK-8检测细胞活力：将P3的细胞以5 000/孔的密度接种于96 孔板，每天设为1 组，每组4 个复孔，并设2 个对照孔。每天于同一时间按照10∶1的比例在待测组加入培养基和CCK8混合物110 μl， 37 ℃、 5% CO2的条件下孵育3 h，后吸取悬液100 μl于新的96 孔板， 测450 nm波长处的吸光度值(A值)，绘制生长曲线。

1.5 多向分化能力检测

1.5.1 成脂分化 选P3的ADSCs和BMSCs，以3×105的密度接种于6 孔板内，待细胞密度达到80%～90%时，更换成脂诱导液。14 d后，多聚甲醛固定,油红O染色,显微镜下观察并拍照。

1.5.2 成骨分化 选P3的ADSCs和BMSCs，以3×105的密度接种于6 孔板内，待细胞密度达到80%～90%时，更换成骨诱导液。

ALP染色：诱导7 d后固定，ALP室温避光孵育30 min，PBS洗涤终止显色反应。半定量分析：使用ImageJ软件，选取多个视野，设置相同阈值，比较染色区占总视野比值，定量对比。

天狼猩红染色：诱导14 d后固定，1%天狼猩红染色18 h， 0.1 mol/L醋酸洗去多余染液，镜下拍照。半定量分析：每孔加入1 ml 0.2 mol/L NaOH/甲醇(1∶1)洗脱液， 在540 nm波长处吸光度值并比较。

茜素红染色：诱导28 d后固定。0.1%茜素红染液室温避光孵育2～3 min至显色，镜下观察拍照。半定量分析：加入1 ml氯化十六烷吡啶洗脱液,置于摇床缓慢摇动2 h， 比较两者在620 nm波长处吸光度值。

1.6 成骨相关基因对比

成骨诱导3、 7、 14 d， 提取细胞总RNA,反转录，qPCR检测成骨相关基因的表达。具体操作步骤参考TIABGEN®及TAKARA®试剂盒说明书，引物由北京奥科生物合成(表 1)。

表1 qPCR引物序列

1.7 膜片电镜及HE对比

常规培养2 组细胞汇合至90%，更换成膜诱导液(含50 μg/ml抗坏血酸)。 10 d后取膜片进行HE染色和电镜观察。利用PS软件测量膜片厚度并进行统计学分析。

1.8 统计学分析

用SPSS 17.0软件进行统计分析， 2 组比较采用成组t检验，不同时间两组比较采用多因素方差分析，检验水准为P<0.05。

2 结 果

2.1 糖尿病建模结果

成模后，糖尿病组随机血糖稳定维持大于16.7 mmol/L(表 2), 2 组大鼠血糖值具有显著性差异(P<0.05)。

2.2 细胞形态观察

原代培养第2 天，见少量ADSCs细胞贴壁， 第4～5 天细胞密度可达80%。BMSCs于第3 天开始贴壁， 7～8 d细胞密度可达80%。细胞形态多为长梭形，多角形或星形(图 1)。

2.3 克隆形成率及生长曲线测定

细胞在接种后第10 天，均形成大量细胞克隆。ADSCs和BMSCs克隆形成率分别为35.67%和25.67%， 2 种干细胞之间有统计学差异(P<0.05)(图 2)。

表 2 糖尿病和正常大鼠血糖值比较Tab 2 Comparison of blood glucose values between diabetic and normal rats (mmol/L，

图1 ADSCs及BMSCs形态学观察 (倒置显微镜，×40) 图 2 细胞克隆形成率和增殖曲线(*:P<0.05; **:P<0.01)

Fig 1 The morphology of AD SCs and BMSCs Fig 2 Clone formation rate and growth cure of ADSCs and BMSCs (Inverted microscope, ×40) (*:P<0.05; **:P<0.01)

细胞均形成显著的S形生长曲线。第一天细胞生长处于滞留期。自第2 天起进入对数生长期，第7 天到达平台期。ADSCs的增殖速率于第3 天后逐渐高于BMSCs,在第4、 5、 7 天时相比有统计学差异(P<0.05)(图 2)。

2.5 多向分化能力检测

2.5.1 成脂分化 2 组细胞均可产生脂滴，脂滴融合为串珠样。ADSCs形成的脂滴数量多且体积较大；BMSCs形成的数量少且较小(图 3)。证实2 种细胞均可定向成脂分化。

2.5.2 成骨分化 ALP染色及定量: 细胞均呈蓝紫色着色，BMSCs中ALP的表达量明显高于ADSCs(图 3)。通过ImageJ软件进行两样本中多个视野染色面积对比，统计分析显示两种细胞有统计学差异(P<0.05)。

天狼猩红染色及定量： ADSCs呈现粗大的胶原束，而BMSCs形成的胶原较为细小(图 3)。定量结果表明:ADSCs的胶原分泌量高于BMSCs， 2 种细胞的染色结果相比有统计学差异(P<0.001)。

茜素红染色及定量： BMSCs有更多的矿化结节形成，少量连接成小片状，而ADSCs形成的矿化结节较少(图 3)。半定量分析表明：BMSCs组的钙盐沉积量显著高于ADSCs组，两者相比有统计学差异(P<0.05)。

图 3 细胞多向分化

2.5 成骨相关基因表达对比

COL-1的表达随时间变化呈逐渐升高趋势，成骨晚期ADSCs中COL-1的表达显著高于BMSCs。ALP、BMP的表达随时间变化呈逐渐降低趋势，成骨早期BMSCs中ALP、BMP的表达显著高于ADSCs。整个过程中OCN、RUNX2、OSX在BMSCs中表达量显著高于ADSCs(图 4)。

图 4 ADSCs及BMSCs成骨相关基因的表达

2.6 成膜能力对比

2 组细胞均可形成大量的细胞外基质，连接成片状。细胞之间通过板状伪足连接。横截面见ADSCs膜片厚度明显大于BMSCs(图 6)，两者之间有统计学差异(P<0.05)。HE染色显示两种细胞均形成细胞-基质-细胞三明治样结构，ADSCs膜片拥有更多的细胞层数以及更丰富的细胞外基质(图 6)，说明ADSCs比BMSCs拥有更强的增殖能力和胶原分泌的能力。

图 5 细胞膜片扫面电镜观及HE染色

3 讨 论

近年来，组织工程技术应用干细胞提升糖尿病患者的成骨能力，已得到多种证据证实[9]。大部分实验基于异体干细胞的获取，而在临床上，此种方法受到一定限制，且其面临的体内的免疫原性仍具有争议性。自体干细胞因其临床易得，能促进长期移植的生存和移植耐受，而成为更有前景的细胞[10]。

现有证据表明，糖尿病患者来源的BMSCs相比正常BMSCs，数量减少，再生能力减弱，增殖和存活能力降低[11-12]，成骨分化显著下降[13]，限制了其在再生方向的应用。而糖尿病患者来源的ADSCs，获取数量并未减少，生长曲线和对照组类似[14]。对于糖尿病患者自体的ADSCs和BMSCs的比较，却并无较多讨论。

通过比较糖尿病大鼠来源的ADSCs和BMSCs的克隆和增殖能力发现，两种细胞均可形成克隆，但ADSCs形成能力更佳。而细胞增殖曲线也表明ADSCs具有更好的增殖潜力。

ALP及茜素红染色显示，BMSCs具有更为显著的成骨能力。但ADSCs胶原定量结果显著高于BMSCs，其可形成更多更粗壮纤维。同时ADSCs中COL-1的表达量显著高于BMSCs。细胞膜片电镜及HE染色结果发现ADSCs形成膜片的层数及厚度的均显著高于BMSCs，ADSCs拥有更强的增殖和胶原分泌的能力。但其他的骨形成相关基因，在 BMSCs中的表达显著高于ADSCs。

ADSCs来源广泛、取材容易、患者痛苦小[15]。正常的ADSCs同时显示出类似于BMSCs的迁移，分化，免疫抑制能力[16]。来源于糖尿病的ADSCs相比BMSCs具有更好的增殖潜力，可能是骨髓中的低氧环境导致BMSCs面临早期的增殖老化[17]。ADSCs能形成更多的胶原及细胞外基质，但BMSCs具有更佳的成骨能力，考虑可能是其他成骨相关基因或后期钙磷沉积的优势作用。虽然BMSCs的特殊性能可提升其应用潜力，但在再生领域中，细胞增殖是促进创伤愈合及组织再生的重要部分，通过体内提升增殖能力来激活内源性干细胞也成为治疗糖尿病并发症的潜在策略[18],且ADSCs更适应标准的培养环境，体外培养可形成更稳定的细胞特性[17]。就此而言，糖尿病患者ADSCs相比BMSCs在自体干细胞应用中具有更好的前景。