灵空山褐马鸡种群遗传多样性研究

武玉珍,李敏,李晓科,张峰

(1.晋中学院 生物科学与技术学院,山西 晋中 030600;2.太原师范学院 生物系,山西 晋中 030600;3.山西大学 生命科学学院,山西 太原 030006)

0 引言

褐马鸡(Crossoptilonmantchuricum)是我国特有的珍稀鸟类,已被国际自然与自然资源保护联盟和国际鸟盟定为全球性濒危物种,列入《世界濒危鸟红皮书》,是国家Ⅰ级保护鸟类[1-2]。褐马鸡主要分布在山西省、陕西省、河北省和北京市等省市的部分林区[3],山西是褐马鸡分布中心和多度中心,主要集中在吕梁山脉。山西灵空山国家级自然保护区位于太岳山脉中段。2005年1月，太岳林局勘测队首次在古县境内发现了野生褐马鸡踪迹，2007年4月首次在沁源县境内发现了4只野生褐马鸡,此后陆续发现了多个褐马鸡种群。目前山西灵空山国家级自然保护区有12个自然群,种群数量为160只～210只[4]。对于这一新发现的褐马鸡地理种群的研究目前主要在资源分布、栖息地环境调查等[5],种群遗传多样性的研究未见报道。

本文采用线粒体DNA分子标记对灵空山保护区褐马鸡个体的线粒体控制区(mtDNA D-loop)以及线粒体细胞色素b(Cytb)基因全序列进行测定与分析,对序列数据进行遗传多样性、亲缘关系、系统发育进行分析,以期为灵空山自然保护区褐马鸡的研究与保护提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料

实验材料:本实验所用样品来自山西灵空山自然保护区救护站4只成年褐马鸡(从野外捡回来的褐马鸡蛋孵化的,可以代表野生种群),采集血液样本,样本号分别为1、3、4、5,样本2缺失。

1.2 方法

1.2.1 褐马鸡血液样品DNA提取

使用天根生化科技有限公司的血液基因组提取试剂盒进行抽提,抽提后分别用微量分光光度计和琼脂糖凝胶电泳检测DNA纯度和完整性。按照文献[6]设计PCR扩增引物(表1),分别扩增褐马鸡的线粒体DNA D-loop和Cytb。

用M13F和M13R对重组子进行测序,双向测序结果拼接后,去掉载体序列,获得目的基因序列,测序仪的型号是ABI 3130XL。

表1 引物设计表

1.2.2 数据分析

用ClustalX 2.0的Align程序进行DNA同源序列排列,并人工核对校正。通过DNAsp和MEGA7.0.26软件计算出褐马鸡4只个体间的遗传多样性参数及个体之间的遗传距离并分别以采用最大似然法(ML)、邻接法(NJ)进行建树。将上述目的片断在http:∥www.ncbi.nlm.nih.gov/进行BLAST同源性比较。

2 结果与分析

2.1 碱基组成

对灵空山国家级自然保护区褐马鸡种群4个样本mtDNA D-Loop和Cytb全序列进行了检测,获得序列片断长度为1 238 bp和1 458 bp,见表2。

表2 山西灵空山褐马鸡种群线粒体D-loop区和Cyt b基因的平均碱基组成

从表2可以看出,D-loop序列中碱基组成 T、C、A和G的平均质量百分含量分别为 30.9%、27.5%、26.9%和14.7%,其中 A+T质量百分含量(57.8%)高于G+C质量百分含量(41.9%),表现出显著的碱基组成偏向性;Cytb序列中,碱基组成T、C、A、G的平均质量百分含量分别为29.4%、12.7%、24.6%、33.4%,其中A+T质量百分含量(54.0%)高于G+C质量百分含量(46. 1%),碱基组成偏向性不显著。

2.2 序列变异特征

用分子进化遗传分析软件——MEGA7.0.26确定多态位点。对本研究所测定的4条褐马鸡mtDNA控制区和Cytb全序列进行比较,分析序列的变异位点。

如表3所示,4只褐马鸡的mtDNA D-loop序列(1 238 bp) 中,共检测到7个变异位点,7个变异位点共定义了3种单倍型,变异位点分别在:22、30、517、547、699、1 051和1 177的碱基。

如表4所示,4只个体的Cytb中有6个变异位点,6个变异位点共定义了2个单倍型,变异位点分别在:90、144、350、585、610和1 350碱基处。全部位点为两碱基间突变。

表3 基于D-loop序列灵空山褐马鸡种群4只个体的变异位点

表4 基于Cyt b序列灵空山褐马鸡种群4只个体的变异位点

2.3 遗传多样性

种群遗传多样性参数统计见表5。从表5可以看出,两条序列D-loop和Cytb褐马鸡单倍型多样性(h)平均值分别为0. 833和0.5;核苷酸多样性平均值(π) 分别为0. 002 83和0.002 06;平均的核苷酸差异数分别为3.5和3,两条序列的遗传多样性参数表明:灵空山自然保护区褐马鸡有较高的单倍型多样性和较低的核苷酸多样性,且D-loop序列的遗传多样性指数较Cytb序列的遗传多样性指数较高。

2.4 遗传距离

不同个体间的Kimura双参数遗传距离见表6和表7。结果表明:4只个体间遗传距离的范围为D-loop区0. 000～0. 006,D-loop的平均遗传距离为:0.003。Cytb4只个体间遗传距离的范围为0. 000～0. 004,Cytb平均遗传距离0.002。

表5 灵空山褐马鸡种群线粒体D-loop区和Cyt b基因的遗传参数

表6 基于线粒体D-loop序列的灵空山褐马鸡种群4只个体之间的遗传距离

从表6可以看出:基于线粒体D-loop的褐马鸡种群内的遗传距离,个体4和个体5之间的遗传距离最大为:0.006,其次是个体4与个体1、3之间的遗传距离为:0.004;而个体5和个体1、3之间遗传距离为0.002;个体1和个体3之间遗传距离最近为0.000。

表7 基于线粒体Cyt b序列的灵空山褐马鸡种群4只个体之间的遗传距离

从表7可以看出:基于线粒体Cytb的褐马鸡种群内的遗传距离,个体3和个体1、4、5之间距离最大为0.004,个体5和个体1、4之间遗传距离最近为0.000。

2.5 系统发育树的构建

利用Mega 7.0软件,基于褐马鸡mtDNA控制区和Cytb全序列的Kimura 双参数遗传距离,利用NJ法构建邻接系统进化树,见图1和图2。

从图1可以看出:个体4和个体5之间的亲缘关系最远,个体4和个体1、3之间的亲缘关系较远,个体5和个体1、3之间的亲缘关系较近,而个体1和个体3之间无变异,亲缘关系最近。

由图2可以看出:个体3和个体1、4、5之间的亲缘关系最远,而个体5和个体1、4之间的亲缘关系最近。综上所述:遗传距离近的个体之间,亲缘关系近;遗传距离远的个体之间,亲缘关系远。

图1 基于D-loop序列用NJ法构建的灵空山自然保护区褐马鸡4个个体的系统发育树

图2 基于Cyt b序列用NJ法构建的灵空山自然保护区褐马鸡4个个体的系统发育树

3 讨论

线粒体DNA(mtDNA)是生物体中唯一的细胞核外遗传物质,以母系遗传方式遗传。其结构简单、稳定、世代间没有基因重组且进化速度较快,能够更直观保存群体突变的发生[7],mtDNA 比核位点更易受遗传漂变的影响[8]。近几年,以线粒体DNA作为分子标记,研究物种的遗传多样性及遗传结构起到很重要的作用。线粒体基因组通常有一个负责复制和转录的非编码区即控制区,线粒体控制区(D-loop)的进化比mtDNA中的其他区域快5～10倍[9],具有碱基替换速率快、存在丰富的序列变异等特点,特别适合于检测种群内及种群间的遗传多样性。由于线粒体DNA控制区的高突变率,有时很短的扩增片段即可解决保护遗传学中所关注的问题,这对于濒危物种有着突出的意义,因为这类物种的基因材料往往很难获得。细胞色素b基因(Cytb)是线粒体13个蛋白编码基因中结构和功能被研究得最为清楚的基因之一,且进化速度适中,适合种群水平差异的检测[10-12]。所以用这两种分子标记不仅可以了解种群的遗传多样性,还可以探讨其形成特定遗传结构的历史原因和地理原因[13-15]。由于线粒体基因组具有母系遗传、多拷贝、缺少遗传重组以及进化速率快等特点,已广泛应用于比较基因组学、分子进化、系统发育重建、谱系地理学及种群遗传学等研究领域[16-19]。

褐马鸡是中国特有的濒危鸟类,目前仅分布在河北小五台山、北京东灵山、陕西黄龙山和山西的吕梁山脉,因为太行山和黄河的阻隔,形成了三个孤立的地理种群,即河北、北京的东部种群,陕西的西部种群和山西的中部种群。灵空山是近年来新发现的褐马鸡分布区,对这一区域褐马鸡种群的来源和遗传背景的研究尚属空白。付玉明[20]对河北小五台山与山西芦芽山、庞泉沟褐马鸡种群进行了遗传多样性分析,结果显示三个区域的种群遗传多样性均较低,小五台山种群与芦芽山、庞泉沟种群之间已经产生了显著的遗传分化,芦芽山和庞泉沟种群之间没有显著的遗传分化。武玉珍[21-25]等对庞泉沟自然保护区和太原市动物园的褐马鸡种群遗传多样性和遗传结构进行了研究,结果显示褐马鸡种群表现出较高的单倍型多样性和较低的核苷酸多样性,说明山西分布的褐马鸡种群的遗传多样性较低,但却存在广泛的个体间遗传变异。本研究实验数据分析结果和上面的研究结果相似,灵空山自然保护区褐马鸡种群具有较高的单倍型多样性和较低的核苷酸多样性,预示着群体曾经历过瓶颈效应后,伴随了迅速的种群扩张与变异的积累。通过遗传距离和系统发育树分析了各个个体之间的亲缘关系。以线粒体DNA的D-loop为分子标记的结果显示4只个体有3个单倍型,序列的变异位点数5,平均核苷酸的差异数为3.5,都较以线粒体DNA的Cytb为分子标记的指数较高,这可能是由于两个分析标记的差异所致。本研究由于取样地点和数量的限制,对褐马鸡遗传多样性水平的评价还不够全面,需在以后的工作中进一步加以完善。

褐马鸡在我国分布范围较小,山西省吕梁山脉是现有野生褐马鸡的分布中心和多度中心,其他分布区的种群数量和分布范围相对较小。山西灵空山国家级自然保护区地处太岳山脉中段,近二百年来没有褐马鸡分布的记录[26],但追溯历史文献却有褐马鸡的记载。汉许慎《说文解字·鸟部 》:“鹖,似雉,出上党,从鸟,曷声”。晋代徐广:“鹖似黑雉,出于上党”。可见汉晋的学者一直认为上党是鹖的主要产地。据清雍正八年《沁源县志》、康熙十二年和乾隆二十八年《长治县志》、雍正十二年《山西通志·潞安府》都记载有“鹖”。沁源属沁州,长治属潞安府,潞安府和沁州都是上党郡的一部分,说明历史上这一带曾经有褐马鸡的分布,一直延续至清代前期,大约在十八世纪以后就销声匿迹[27]。历史记载山西东南部太岳山与太行山是褐马鸡的盛产地。山西灵空山国家级自然保护区距离有褐马鸡分布最近的山西五鹿山国家级自然保护区约80 km,并有汾河相隔,有人推断灵空山的褐马鸡是从五鹿山扩散而来。但褐马鸡是留鸟,善奔跑会滑翔,不善飞翔,最大扩散距离约 5.7 km[28]。褐马鸡是否跨越汾河、翻越崇山峻岭,从吕梁山脉南端来到太岳山脉中段,还有待于进一步证实。

与此相似,作为褐马鸡西部种群所处的陕西黄龙山国家级自然保护区,1998年多个国家联合调查组查验证实黄龙山林区是褐马鸡的实际分布区[29],种群数量近2 000只[30],誉为陕西省野生动物保护史上四次重大发现之一[31]。据史料记载,明朝以前的史籍考证表明,陕北黄土高原的广大地区曾有大量的褐马鸡分布[32]。陕西黄龙山国家级自然保护区距离最近的褐马鸡分布区山西省五鹿山自然保护区有100多公里,且有黄河相隔。黄龙山褐马鸡种群是由山西省扩散迁移去的,还是本地的固有地理种群,目前尚有争议[33],需要进一步的科学实证。

灵空山和黄龙山虽然都有史料记载是褐马鸡的主要分布区,但也有近二百年的历史空缺,要做出明确的结论还需要进一步的科学实证。

致谢山西灵空山国家级自然保护区管理局和山西沃成生态研究所给予采取样品的帮助,特此致谢。