金铜合金纳米簇的制备及其对苦味酸的化学传感

牛琴琴，张雨婷，双少敏，张彦

(山西大学 化学化工学院,山西 太原 030006))

0 引言

随着现代科学技术的不断发展,金属材料的尺寸研究已向越来越小的趋势发展,特别是在纳米尺度范围更受人们的关注[1]。纳米级别的金属材料主要是金属纳米团簇,它通常包含几个到上百个原子,尺寸一般小于2 nm[2-3],与块状金属相比有许多优异的性能,比如:较小的尺寸、较大的比表面积、荧光可调、低毒性、良好的生物相容性、催化性能、光致发光等[4-6]。因而,在环境监测[7]、小分子检测[8]、临床治疗[9]、生物成像[10-11]等很多领域都有应用。此外,向单金属材料中添加另一些金属元素形成合金材料,由于协同效应及组成金属元素的种类、结构、性质的多样性质,这种合金材料相对于单金属材料会产生更多优异的性能,比如:荧光强度增大、催化活性提高、稳定性和抗干扰能力增强等[12-15]。因此,合金纳米粒子的合成及其在化学传感中的应用是研究的热点。目前,微波是由电场和磁场组成的电磁波,微波加热是一种新型的内源性加热方式。微波加热技术具有受热均匀、反应快速高效、副反应少、环境污染低、操作方便等优点,是一种备受人们青睐的新型化学合成技术[16-17]。

苦味酸(2,4,6-三硝基苯酚,简称PA),是一种黄色、无味、有毒的硝基酚类化合物,主要应用于染料、烟花、炸药、玻璃和皮革工业、火箭燃料、农业杀菌剂和除霉剂、医药杀菌剂及收敛剂等方面[18-21]。然而,随着现代工业的发展,污染物中PA的排放量不断增加,严重影响了人体的眼睛、皮肤和呼吸系统,甚至导致肝脏、肾脏及呼吸器官的损害,也可能引起贫血、癌症等慢性疾病[22-23]。因此,测定PA的含量对于环境监测、药物分析、生化测定、人类健康等方面都具有重要意义。目前测定PA的方法主要有:电化学法[24]、质谱法[25]、表面增强拉曼光谱[26]、表面等离子体共振[27]和气相色谱法[28]等。但这些方法中有的成本高、耗时长,有的前处理复杂、干扰大,有的操作不够简便快速,有的实验设备要求高等[29-30],因而其实际应用受到限制。采用荧光光谱法测定PA含量,成本低廉、响应时间快、操作简单、方便可行,能够有效避免上述缺点。

本文以组氨酸(L-His)作修饰剂,以硝酸铜(Cu(NO3)2)、氯金酸(HAuCl4)为原料,利用微波加热技术合成绿色荧光金铜合金纳米簇(His-AuCuNCs)。在该方案中,组氨酸既充当还原剂又充当保护剂,不需要添加额外试剂;合成的His-AuCuNCs水溶性好、稳定性好、荧光性能高;微波加热不仅提高了反应速率和产物纯度,而且还减少了环境污染。所以,这是一种高效、绿色的合成方法。此外,采用紫外-可见吸收光谱、荧光光谱、透射电子显微镜等方法对合成的His-AuCuNCs进行表征;研究发现AuCuNCs的激发光谱与PA的吸收光谱有相当程度的重叠,基于吸光体PA和荧光体AuCuNCs之间的内滤效应,将不同浓度的PA加入His-AuCuNCs溶液中,会使其荧光发生不同程度的猝灭。因此,构建了一种His-AuCuNCs作为荧光探针来简便、快速地检测PA的化学传感体系,已成功应用于实际水样中PA含量的检测。

1 实验部分

1.1 试剂与仪器

表1 实验试剂

表2 实验仪器

1.2 金铜合金纳米簇的制备及合成条件优化

1.2.1 金铜合金纳米簇的制备

以组氨酸(L-His)为还原剂和保护剂,通过微波辅助加热Cu(NO3)2·3H2O和 HAuCl4·3H2O两种金属盐,制备出绿色荧光金铜合金纳米簇(His-AuCuNCs)。具体步骤如下:在室温下,将配制好的4 mL 0.1 mol·L-1的L-His溶液、700 μL 0.01 mol·L-1的Cu(NO3)2溶液和200 μL 0.01 mol·L-1的HAuCl4溶液混合于烧杯中,盖上表面皿,微波高火加热15 min,待冷却至室温后,用5 mL二次水润洗小烧杯和表面皿,超声震荡5 min,再以10 000 r min-1转速离心5 min,得到绿色荧光His-AuCuNCs溶液。最后,将His-AuCuNCs储存于4℃ 环境中备用。

1.2.2 金铜合金纳米簇的合成条件优化

采用控制变量法,探究了L-His与Cu(NO3)2或HAuCl4物质的量比例、微波加热温度和加热时间等主要因素对合成His-AuCuNCs光学性能的影响。具体操作如下:配置一定量体积的0.1 mol·L-1的L-His溶液、0.01 mol·L-1的Cu(NO3)2溶液和0.01 mol·L-1的HAuCl4溶液以备用。首先,固定Cu(NO3)2的用量,改变L-His与HAuCl4物质的量比例制备出若干His-AuCuNCs,比较其荧光强度,得到His-AuCuNCs最强荧光下所用HAuCl4溶液的最佳物质的量。其次,固定最佳物质的量HAuCl4溶液,改变L-His与Cu(NO3)2物质的量比例制备出若干His-AuCuNCs,比较其荧光强度,得到His-AuCuNCs最强荧光下所用Cu(NO3)2溶液的最佳物质的量。再次,分别选用微波低火(119 W)、中低火(231 W)、中火(385 W)、中高火(539 W)、高火(700 W)对最佳物质的量比例合成的His-AuCuNCs进行加热,比较其荧光强弱,得到微波加热的最佳温度。最后,在上述最佳物质的量比例和温度下,通过改变微波加热时间5 min、10 min、15 min、20 min、25 min、30 min、35 min,制备出不同加热时间下的His-AuCuNCs,比较其荧光强度,得到微波加热的最佳时间。

1.3 金铜合金纳米簇的表征

采用紫外-可见分光光度法,探究相同条件下微波辅助合成的His-AuCuNCs、His、His-AuNCs、His-CuNCs的光学性质。配置一定浓度的上述溶液,分别移取2 mL His-AuCuNCs、His、His-AuNCs、His-CuNCs溶液和1 mL的磷酸缓冲液(PBS, pH=7, 0.01 mol·L-1)加入到荧光比色皿中,置于紫外-可见分光光度计中,在200～800 nm波长范围内扫描其吸收光谱。

采用荧光光谱法对His-AuCuNCs的光致发光性质进行了研究。配置一定浓度的His-AuCuNC水溶液,移取2 mL His-AuCuNCs和1 mL的磷酸缓冲液(PBS,pH=7,0.01 mol·L-1)加入到荧光杯中,置于荧光仪中,扫描其激发和发射光谱,记录荧光光谱的变化。

采用透射电子显微镜对合成的His-AuCuNCs的表面形态和分散情况进行了观察,并测量评估了其粒径。将该AuCuNCs的水溶液,滴于附有碳膜的铜网上,真空干燥后,用透射电子显微镜进行测试。

1.4 优化金铜合金纳米簇对PA的传感条件

金铜合金纳米簇对PA的传感性能受His-AuCuNCs的用量、缓冲溶液的pH值、孵育时间、离子强度等因素的影响。因此,通过控制变量法对其影响因素进行了优化。

首先,取2.0 mL二次水和10 μL的AuCuNCs溶液注入荧光杯,置于荧光仪中,设定激发Ex=370 nm,狭缝λ=10 nm,扫描其荧光光谱;再加入100 μL 0.001 mol·L-1的PA溶液,测其荧光强度并记录两次最强发射峰的数据。保持其他操作不变,改变AuCuNCs的用量测其荧光光谱,记录每次的数据并作比较,得到AuCuNCs最佳用量。

其次,将上述得到的最佳用量为120 μL的AuCuNCs溶液和2.0 mL的PBS缓冲液(0.01 mol·L-1,pH=2)注入荧光杯中,设定激发Ex=370 nm,狭缝λ=10 nm,测其荧光光谱。再加入100 μL 0.001 mol·L-1的PA溶液,测其荧光光谱并记录数据。保持其他操作不变,依次改变PBS缓冲液的pH值(pH=2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12),测量每次改变pH后的荧光光谱并记录数据,通过比较得到最适宜的pH值。

再次,取2.0 mL的PBS缓冲液(0.01 mol·L-1,pH=7)和120 μL的AuCuNCs溶液注入荧光杯中,设定激发Ex=370 nm,狭缝λ=10 nm,测其荧光光谱。再加入100 μL 0.001 mol·L-1的PA溶液,测其荧光光谱。之后每隔2 min测一次荧光强度,直到其荧光基本不发生变化为止,记录数据并得到PA使得AuCuNCs荧光猝灭的最佳时间。

最后,将2.0 mL的PBS缓冲液(0.01 mol·L-1,pH=7)和120 μL的AuCuNCs溶液注入荧光杯中,设定激发Ex=370 nm,狭缝λ=10 nm,测其荧光强度作为空白对照。再分别加入0-0.3 mol·L-1的NaCl溶液,测各自的荧光光谱并记录数据,比较加入不同浓度NaCl溶液后荧光强度是否发生变化。

1.5 金铜合金纳米簇对PA传感的灵敏度和选择性

实验前先制备新鲜的His-AuCuNCs溶液和PA溶液。室温下AuCuNCs对 PA的荧光检测方法如下:将2.0 mL的PBS缓冲液(0.01 mol·L-1, pH=7)和120 μL的AuCuNCs溶液加入荧光比色皿中,设定激发Ex=370 nm,狭缝λ=10 nm,测荧光光谱并记录数据(作为空白对照)。取10 μL不同浓度的PA标准溶液加入含有 120 μL AuCuNCs 的 PBS 缓冲液中,室温下孵育1 min后,记录 AuCuNCs的颜色变化和荧光强度值。

为进一步验证该检测系统的选择性,在相同条件下,应用上述检测PA的方法也检测了其他不同的干扰物(PHE、NB、TNT、o-DHB、o-NP、K+、Ca2+、Pb2+、Ba2+、Mn2+、Al3+、CO32-、NO3-、Cl-)对AuCuNCs 荧光强度的影响[21]。其中,其他干扰物浓度均高于PA浓度的 50 倍。在激发波长为370 nm下扫描其荧光光谱,记录实验数据。

1.6 实际水样中PA含量的检测

实际水样取自山西大学令德湖水和实验室自来水。首先,将水样过滤,除去水中杂质,以10 000 r·min-1离心10 min。其次,用移液器移取2.0 mL的湖水(自来水)和120 μL的His-AuCuNCs溶液注入荧光杯,置于荧光仪中,设定激发Ex=370 nm,狭缝λ=10 nm,测其荧光光谱。然后,分别将1.50 μmol·L-1、2.50 μmol·L-1和15.00 μmol·L-1的PA加入水样中,测其荧光强度。

2 实验结果与讨论

2.1 制备AuCuNCs的条件优化

为了制备出具有最佳光学性能的His-AuCuNCs,通过控制变量法分别改变了L-His与Cu(NO3)2物质的量之比、L-His与HAuCl4物质的量之比、微波加热温度、微波加热时间等实验条件,探究了合成His-AuCuNCs的主要因素对其荧光强度的影响。

从图1(A)可知,固定Cu(NO3)2的用量时,当L-His与HAuCl4的物质的量之比为800∶4时,合成的AuCuNCs荧光强度最强。从图1(B)可知,在最佳HAuCl4物质的量时,当L-His与Cu(NO3)2的物质的量之比为800∶14时,AuCuNCs荧光强度最强。综上,当L-His、Cu(NO3)2、HAuCl4的物质的量之比为400∶7∶2时,合成的His-AuCuNCs荧光强度最佳。从图1(C)可知,在最佳物质的量比例时,微波高火(700 W)加热合成的AuCuNCs荧光最强。从图1(D)可知,在最佳物质的量比例和高火加热条件下,微波加热时间为30 min时合成的AuCuNCs荧光强度最佳,但是,微波加热时间在15～35 min之间时荧光强度的变化幅度并不是很大,所以考虑到经济效率,设定微波加热时间为15 min。综上可知,通过优化制备参数条件,表明L-His、Cu(NO3)2、HAuCl4的物质的量之比为400∶7∶2时、微波高火加热15 min,达到制备His-AuCuNCs的最佳效果。

2.2 AuCuNCs的稳定性

纳米团簇的稳定性对于其实际应用影响较大,为考察His-AuCuNCs的光学稳定性,分别对储存于4℃下放置不同时期后的His-AuCuNCs溶液进行荧光强度的测定。如图2所示,His-AuCuNCs 溶液储存于4℃下,放置6个月后,其荧光强度几乎无变化,表明所制备的His-AuCuNCs储存于4℃时具有优良的光稳定性。

2.3 AuCuNCs的性能表征

采用紫外-可见吸收光谱(UV-Vis)、荧光光谱(FL)和透射电子显微镜(TEM)对制备的His-AuCuNCs进行了表征,如图3所示:

图1 优化AuCuNCs的制备条件。(A)和(B)是不同原料比例的L-His和HAuCl4、Cu(NO3)2对合成AuCuNCs荧光强度的影响;(C)和(D)分别是微波加热温度和加热时间对合成AuCuNCs荧光强度的影响

图2 His-AuCuNCs 的光稳定性

图3(A)是His-AuCuNCs、L-His、His-AuNCs和His-CuNCs的紫外光谱。在250 nm处的吸收峰His-AuCuNCs最高,His-CuNCs次之,L-His和His-AuNCs很微弱。由此可知,合金AuCuNCs的吸收峰比单金AuNCs或CuNCs的吸收峰要高,AuCuNCs中组氨酸对吸收峰几乎没有影响。图3(B)是不同激发下的His-AuCuNCs的荧光光谱图。随着激发波长从310 nm～370 nm增大,AuCuNCs的荧光逐渐增强;当激发波长大于370 nm后,AuCuNCs的荧光强度反而降低。所以选用370 nm作为AuCuNCs的最佳激发波长。图3(C)中AuCuNCs的荧光激发光谱(Ex)和发射光谱(Em)表明,在最佳激发波长为370 nm时,AuCuNCs在500 nm处有很强的发射峰。从图3(D)的透射电子显微镜图(TEM)表明,AuCuNCs呈球形,分散性良好;插图中的粒径分布直方图可知AuCuNCs平均粒径约为1.5 nm。

2.4 探究AuCuNCs与AuNCs、CuNCs的荧光强度

在相同实验条件下,按照上述实验探索得出的最佳原料比例、微波加热温度和时间来制备His-AuCuNCs。通过控制变量法,只将AuCuNCs原料中的Cu(NO3)2和 HAuCl4换为同等量的HAuCl4或Cu(NO3)2,制备出组氨酸修饰的AuNCs和CuNCs。在激发波长为370 nm时,测得AuCuNCs、AuNCs、CuNCs 三者的荧光光谱如图4所示。

从图4可知,同等条件下制备的组氨酸修饰的荧光AuCuNCs、AuNCs和CuNCs中,在370 nm激发下,测得AuCuNCs的荧光发射强度比AuNCs和CuNCs的荧光发射强度高。这表明我们制备的合金AuCuNCs荧光性能比单种金属AuNCs或CuNCs的荧光性能强。

图3 (A)不同物质的紫外-可见吸收光谱图

图4 在370nm激发下的AuCuNCs、AuNCs、CuNCs荧光光谱图

2.5 优化AuCuNCs对苦味酸的检测条件

His-AuCuNCs作为化学传感器用于检测PA的含量,是基于不同浓度的PA溶液加入到His-AuCuNCs溶液中会使其荧光发生不同程度的猝灭。然而,AuCuNCs的用量、缓冲溶液的pH值、孵育时间、离子强度(NaCl)等因素都会影响PA的检测。因此，本文通过控制变量法对测定PA的影响因素进行优化。

图5(A) 是His-AuCuNCs的用量对传感器检测PA的影响。随着AuCuNCs用量增大其荧光强度也明显增强,但当AuCuNCs达到120 μL以后,荧光强度的增加幅度趋于平缓。向AuCuNCs中加入0.1 μmol·L-1PA后,得到荧光强度的降低值F0-F(F0代表AuCuNCs本身的荧光强度,F代表加入PA后的荧光强度)。F0-F值在120 μL最大,且考虑到经济效益,选用120 μL AuCuNCs作为最佳用量来检测PA。

图5(B)是不同pH值的PBS缓冲液对AuCuNCs检测PA的影响。从图可知,当溶液pH值在3.0～12.0范围内,加入PA前后AuCuNCs的荧光几乎不受pH影响;而pH值为2.0时荧光极其微弱,所以后续实验选择在中性环境下进行。

图5(C)是加入PA后孵育时间对传感体系荧光强度的影响。当0.1 μmol·L-1PA加入AuCuNCs溶液时,荧光强度在1 min内迅速降低,之后趋于稳定不再下降。说明PA对AuCuNCs的响应时间非常快,后续实验选择孵育时间为1 min。图5 (D) 是离子强度对AuCuNCs荧光强度的影响。向AuCuNCs溶液中加入不同浓度的NaCl溶液,从图中变化趋势来看,该传感体系的荧光强度没有发生明显变化,说明离子强度对AuCuNCs检测PA几乎没影响。

图5 (A) AuCuNCs的用量对检测PA的影响;(B) pH值对AuCuNCs传感PA的影响,PA浓度为0.1 μmol·L-1;(C) 加入0.1 μmol·L-1 PA后孵育时间对AuCuNCs传感体系的影响;(D) 不同浓度NaCl存在下AuCuNCs的荧光强度

2.6 探究AuCuNCs的选择性

选择性是判断一个传感器能否良好的应用于实际样品检测的关键因素。本文探讨了不同硝基酚类化合物(PHE、NB、TNT、o-DHB、o-NP)、阳离子(K+、Ca2+、Pb2+、Ba2+、Mn2+、Al3+)、阴离子(CO32-、NO3-、Cl-)等潜在干扰物质存在下,AuCuNCs对PA的荧光响应情况。

图6 AuCuNCs对PA与其他阴离子、阳离子、硝基酚类化合物等潜在干扰物质的选择性实验,浓度:PA: 0.1 μmol·L-1,其他共存物: 5 μmol·L-1

先向AuCuNCs中加入5 μmol·L-1上述阴离子、阳离子、硝基酚类化合物等潜在干扰物质,370 nm激发下测其荧光光谱;再向上述溶液中加入0.1 μmol·L-1PA溶液,在370 nm激发下测荧光光谱。如图6所示,这些共存物质的浓度是PA浓度的50倍,但是,只有加入PA才能引起AuCuNCs的荧光显著猝灭,其他潜在干扰物对AuCuNCs的荧光强度几乎无影响。实验说明AuCuNCs对PA具有良好的选择性,和PA具有相似结构的硝基酚类化合物也不会干扰AuCuNCs对PA的检测。

2.7 AuCuNCs对PA传感的灵敏度

基于PA对 AuCuNCs的荧光猝灭作用,本文研制了荧光AuCuNCs测定苦味酸浓度的化学传感新方法。

图7 加入不同浓度的PA(从上到下:0～385 μmol·L-1)后AuCuNCs传感体系的荧光响应图

在最佳实验条件下,将不同浓度的PA加入到His-AuCuNCs 溶液中,如图7所示,随着PA标准溶液浓度的增加,AuCuNCs荧光强度逐渐降低。当PA浓度在2.1×10-10～5.2×10-4mol·L-1范围内时,PA的浓度c与传感体系的相对荧光强度F0/F之间满足良好的线性关系(插图):(F0/F)=0.7406+0.025 C(其中:F0表示没有加PA时AuCuNCs的荧光强度,F表示加入PA后AuCuNCs的荧光强度),线性相关系数为R2=0.995,检测限为0.46 nmol·L-1,表明AuCuNCs传感体系检测PA含量具有线性范围宽、检出限低的优点。

2.8 AuCuNCs与PA之间的反应机理

荧光内滤效应,通常发生在吸收剂和荧光团之间,由吸收剂对荧光团产生的激发或发射光谱的吸收而导致荧光减弱的现象,即荧光猝灭。吸光体的吸收光谱应具有与荧光体的激发或发射光谱相当程度的重叠区域,是分子间发生内滤效应的必要条件之一[31-32]。图8为PA的紫外-可见吸收光谱(曲线a)和AuCuNCs的荧光激发光谱(曲线b)。由图8可知,PA分别在206 nm和354 nm处有两个强烈的吸收峰;而AuCuNCs在270～500 nm内的激发光谱宽而连续,最大激发峰位于370 nm。比较两谱图可见,PA的吸收带与AuCuNCs的荧光激发光谱显示出较好的重叠,表明当AuCuNCs与PA共存时,PA和AuCuNCs之间发生内滤效应,即PA吸收AuCuNCs激发光能量,从而导致Au NCs的荧光强度显著降低甚至猝灭。

图8 PA的紫外-可见吸收光谱(a)和AuCuNCs的荧光激发光谱(b)

2.9 实际水样中PA含量的检测

为了评估AuCuNCs对PA传感的实用性和可行性,采用标准加入法对山西大学令德湖水和实验室自来水中PA的含量进行了测定。如表3所示,将浓度为1.50,2.50,3.50 μmol·L-1的PA标准溶液分别加入到实际水样中,通过AuCuNCs传感体系检测实际水样中PA浓度,得到回收率为97.2%～102.7%,经6次测定后的相对标准偏差(RSD)低于3.0%,进一步证实了荧光His-AuCuNCs传感器检测实际水样中PA含量的可行性。

3 结论

本文采用微波加热法,以Cu(NO3)2和 HAuCl4为原料,L-His为保护剂和还原剂,制备出一种水溶性良好的绿色荧光His-AuCuNCs。基于苦味酸对His-AuCuNCs荧光猝灭作用,建立了一种快速检测苦味酸含量的新方法,并已成功应用于实际水样中苦味酸含量的测定。此方法在中性环境、室温反应1 min后,随着苦味酸浓度的增加体系荧光强度下降,苦味酸在2.1×10-10～5.2×10-4mol·L-1浓度范围内与AuCuNCs荧光强度呈线性关系,检出限为0.46nmol·L-1,回收率为97.2%～102.7%。该实验由于反应条件温和、制备工艺简单、响应特性优良、抗干扰能力强、绿色环保等优点,在环境水质中检测苦味酸含量具有良好的应用前景。

表3 His-AuCuNCs荧光传感体系检测实际水样中的PA