响应面法优化冻绿果实黄酮提取工艺

张蕾,孙丹丹,孔冬梅

(山西大学 生命科学学院,山西 太原 030006)

冻绿(Rhamnusutilis)是我国分布较广的一种落叶灌木或小乔木,隶属于鼠李科鼠李属。冻绿果实具有清热利湿、消积通便的功效[1]。我国部分地区有将其果实和叶片用来助消化、解酒、保肝、抗病毒等民间应用,但关于冻绿药理作用或活性成分的研究鲜见报道。最近有研究发现,冻绿茎的提取物可以明显抑制大肠杆菌、痢疾杆菌、伤寒杆菌等致病菌,该研究还从其乙醇提取物中分离得到了槲皮素、墨沙酮、山萘素等8个化合物[2]。李硕等以冻绿种子为原料浸提油脂,并从中检测到21种脂肪酸,其中含有丰富的人体必需的亚油酸和亚麻酸[3]。高霞等利用超声辅助乙醇提取法测得冻绿叶含有高达35 mg/g的总黄酮,并推测这可能与冻绿叶较强的抗氧化功能和抑菌作用有关[4]。

鼠李属植物中主要含有蒽醌[5-6]、蒽醌甙[7]、酚类[8]、黄酮[5,9-11]等化学成分。笔者的前期研究也表明,冻绿植株中含有丰富的黄酮类物质。已知黄酮类化合物有抗氧化[12]、抗病毒[13]、保肝[14]、抗癌[15-16]、降低胆固醇[17]、改善血管通透性等生物活性及药用价值[18-19],故研究冻绿黄酮具有一定的科学意义。目前未见冻绿果实黄酮相关方面的研究报道。本研究以冻绿果实为原料,采用响应面法确定乙醇超声辅助提取总黄酮工艺,并了解其含量,探讨冻绿民间药用的理论依据,以期为冻绿资源的合理开发利用及其活性成分的深入研究奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

成熟的冻绿果实于2017年2月份采于山西省吕梁市交口县石口乡南山。

1.2 研究方法

1.2.1 芦丁标准曲线绘制

参考文献[20]的方法稍加修改:称取4 mg芦丁标准品,用体积百分数为60%乙醇配制成0.2 mg/mL的芦丁标准溶液。精确量取该溶液、1、2、3、4、5 mL置于6支比色管中,每管加入体积百分数为5% NaNO2溶液0.3 mL,摇匀,静置6 min;加入0.3 mL体积百分数为10% 硝酸铝,摇匀,静置6 min;加入体积百分数为4% NaOH溶液4 mL,摇匀;加入体积百分数为60%乙醇定容至10 mL,摇匀,静置20 min,在510 nm下测定吸光度。以芦丁溶液浓度为X轴,吸光度为Y轴,绘制标准曲线,拟合得到线性回归方程Y=10.286X+0.010 7,相关系数R2=0.999 2。

1.2.2 冻绿果实黄酮样品溶液的制备

新鲜冻绿果实于电热恒温鼓风干燥箱中40℃下烘干至恒重,粉碎机粉碎,过70目筛。称量1 g粉末,加入一定体积的乙醇溶液,摇匀后放入数控超声清洗仪中40 kHz功率下进行超声提取,处理后的溶液在10 000 r/min条件下离心15 min;取上清液,加60%乙醇将体积定容到50 mL得样品溶液。

1.2.3 单因素试验设计

分别设定不同的液料比(15、20、25、30、35、40 mg/L)、乙醇浓度(40%、50%、60%、70%、80%、90%，体积百分数，下同)、提取温度(20、30、40、50、60、70 ℃)和提取时间(10、20、30、40、50、60 min)对冻绿果实黄酮进行超声提取,考察这4个因素对黄酮提取量的影响。所有试验均重复3次。

1.2.4 响应面法优化冻绿果实黄酮的提取工艺

根据Box-Behnken中心组合设计原理,在单因素试验结果的基础上,用Desingn-Expert 8.0.6软件设计响应面试验,试验因素及水平见表1。

表1 响应面试验因素与水平

1.2.5 样品溶液中黄酮含量的测定

取样品溶液5 mL,加入60%乙醇溶液定容到10 mL,即稀释2倍。取稀释液1 mL,按照1.2.1的方法测定样品溶液在510 nm波长下的吸光值。依据芦丁标准曲线计算出样品溶液浓度c(mg/mL),再由以下公式(1)计算出冻绿果实黄酮提取量。

(1)

1.3 数据处理

单因素试验数据用Excel 2016和Origin 8.0软件处理,结果以平均数±标准差(SE)表示,响应面试验结果用Design-Expert 8.0.6软件分析。

2 结果与分析

2.1 单因素试验结果

2.1.1 液料比对冻绿果实黄酮提取量的影响

在不同液料比条件下,用60%的乙醇对冻绿果实粉末在20℃下超声处理20 min,黄酮提取量随液料比的变化趋势如图1(A)所示。可知,随着液料比的增加,黄酮的提取量先增大后减小,当液料比为35∶1时,黄酮提取量最大。这是因为当液料比较小时,随着液料比的增加,冻绿果实粉末与提取液的接触面增加,黄酮类物质向溶剂溶出的阻力减小,使得提取液中溶解的黄酮含量增加。当液料比达到35∶1后继续增大,可能会因为过多的溶剂对超声波产生一定的吸收,或因溶剂体积过大而影响传质过程,从而导致提取液中的黄酮类物质不增反降[21]。所以，35∶1的液料比较适宜。

2.1.2 乙醇浓度对冻绿果实黄酮提取量的影响

按35 mg/L的液料比加入不同浓度的乙醇,在40℃下对冻绿果实粉末超声处理20 min,黄酮提取量随乙醇浓度的变化见图1(B)。可以看出,当乙醇浓度为40%～60%时,冻绿果实黄酮的提取量随乙醇浓度的增加缓慢增大,当乙醇体积百分数达到70%时,黄酮提取量迅速达到最高,之后随着乙醇浓度提高,黄酮提取量又迅速下降。这主要是由于提取剂随着乙醇浓度的变化其极性发生变化,只有在适当极性下才能保证提取剂中黄酮的溶解量达到最大。因此,乙醇浓度为70%时较利于冻绿果实黄酮的提取。

图1 各单因素对冻绿果实黄酮提取量的影响

2.1.3 提取温度对冻绿果实黄酮提取量的影响

将35 mL体积百分数为70%的乙醇溶液加入1 g冻绿粉末中,在不同温度下超声处理20 min，结果见图1(C)。由图1(C)可知,随着提取温度的升高,黄酮提取量也在增加,40℃时黄酮提取量达最大,超过40℃后温度越高黄酮提取量越小。这可能是由于分子运动会随温度升高而加快,从而使黄酮类化合物的溶解度增加,但过高的温度又会使热敏性的黄酮类化合物结构遭到破坏[22],使得溶液中总黄酮含量降低。因此，提取温度控制在40℃左右比较适宜。

2.1.4 提取时间对冻绿果实黄酮提取量的影响

1 g冻绿粉末中加入70%的乙醇溶液35 mL,并在40℃下进行超声提取，结果见图1(D)。由图1(D)可知,随着提取时间的增加,冻绿黄酮的提取量先增加后减少,20 min时黄酮提取量达最大。这是因为黄酮类物质的充分溶出需要足够的时间,但过长时间的超声作用可能使部分黄酮类成分发生降解。因此,选择提取时间20 min比较适宜。

2.2 响应面试验结果

响应面试验方案和结果如表2所示。

2.2.1 模型建立与显著性分析

对试验结果经过二次回归拟合后,得出回归方程如下:

Y=61.70+5.24A-0.85B-2.32C-1.63D-1.25AB+2.53AC+0.86AD+2.52BC+0.63BD+0.43CD-5.60A2-1.07B2-5.29C2-3.78D2

对上述回归模型进行方差分析,结果见表3。模型R2=0.9876,说明响应值和自变量之间的关系显著,模型与实际试验值拟合较好。模型P<0.000 1,表明该方程模型达到极显著水平。失拟项P=0.328 3>0.100 0,表明该回归模型良好拟合了试验结果,试验误差小。因此,可用这个回归模型分析和预测超声辅助提取冻绿果实黄酮量的结果。

各项方差分析表明,一次项B、C和D对试验结果影响极显著(P<0.01),根据F值可知,各因素对黄酮提取量的影响由大到小依次为:提取时间>提取温度>乙醇体积百分数>液料比。二次项中AB、AC和BC对试验结果影响极显著(P<0.01),AD对试验结果影响显著(P<0.05)。平方项各值均对试验结果有极显著影响(P<0.01)。

表2 响应面试验设计方案及结果

2.2.2 响应面交互作用分析

根据回归模型绘制出交互因素响应面图(图2)。

曲面的陡峭程度反映了响应值对操作条件变化的敏感程度。由图2可以看出,四个因素中两两之间存在一定交互作用。结合表3可知,虽然单因素液料比对黄酮提取量的影响不显著,但液料比与其他任一因素的交互作用都达到显著水平,同时单因素提取时间对黄酮提取量的影响最大,但它与提取温度和与乙醇浓度之间的交互作用并未达到显著水平,显示不同工艺条件与黄酮提取量之间存在一种复杂的非线性关系。等高线的圆心处是响应值存在极值的操作条件。

表3 回归方程方差分析

2.2.3 工艺确定及模型验证

用Design-Expert 软件对上述模型进行分析,得出最佳理论点为液料比35.06(mL:g)、乙醇体积百分数65.44%、提取温度38.25℃和提取时间18.45 min,此时得到冻绿果实黄酮提取量的理论最大值为62.57 mg/g干重。为方便操作,将各理论点分别调整为液料比35(mL:g),乙醇体积百分数65%、提取温度38 ℃,提取时间18 min,进行3次平行验证试验,实际得到黄酮提取量平均值为62.36 mg/g干重,与理论最大值接近，说明回归模型可以较好地反映出冻绿果实黄酮提取的最佳条件。

3 讨论

已有研究表明,鼠李属的植物普遍含有黄酮类物质,且不同部位黄酮含量会有一定差异。Ye等对新疆鼠李(R.songorica)黄酮含量测定的结果显示,总黄酮在不同部位的分布情况为果实(11.41%)>叶片(2.42%)>茎(1.10%)[9]。本研究在冻绿果实中提取到黄酮含量为62.36 mg/g干重,远高于高霞在叶片中提取到的黄酮含量35.07 mg/g干重[4],这一点与新疆鼠李的结果类似。除了物种和部位的不同外,提取工艺可能是造成不同部位黄酮含量差异的另一个因素,总黄酮成分构成复杂,植物体不同部位所适合的提取工艺可能会有所不同,而同一部位使用不同方法提取效果也会有所差异[23]。菠萝蜜(Artocarpusheterophyllus)果皮黄酮提取研究发现,在最优工艺条件下,酶法提取黄酮类化合物得率和纯度均高于有机溶剂浸提法,提取物的抗氧化性也是前者强于后者[24]。本研究所用成熟果实和高霞研究中所用幼嫩叶片是不同季节采自同一地点的冻绿种群,且均是用超声辅助乙醇溶剂的方法提取黄酮[4],所以取材部位和采集时间是造成二者黄酮含量差异的主要原因。从已有报道来看,由于植物种类、取材部位、提取方法、采集时间等内外因素的不同,不同植物材料提取所得黄酮含量往往有较大差异,如均以材料干重计,灰枣(Zizyphusjujubecv. Huizao)果肉总黄酮含量仅为3.266 mg/g[25],苦参(Sophoraflavescens)种子总黄酮含量约13.49 mg/g[26],银杏(Ginkgobiloba)叶和牡丹(Paeoniasuffruticasa)种皮的黄酮含量分别为55.4[27]和74.839 mg/g[17],金花葵(Hibiscusmanihot)花中总黄酮含量则高达126.67 mg/g[28]。本研究所得冻绿果实总黄酮含量处于中等水平。

图2 各因素交互作用对冻绿果实黄酮提取量影响的响应面图

4 结论

对冻绿果实黄酮提取工艺进行探究,采用超声辅助乙醇提取法,单因素试验考察了不同因素对提取量的影响,进一步的响应面试验得到了可预测黄酮提取量的二次回归模型。模型分析表明,冻绿果实黄酮超声辅助提取最优的工艺条件为液料比35(mL:g)、乙醇体积百分数65%、提取温度38 ℃、提取时间18 min。在该条件下,冻绿果实黄酮实际提取量为62.36 mg/g干重,与理论值62.57 mg/g干重基本吻合。该工艺条件可为冻绿资源的开发利用提供理论参考。

致谢感谢山西省吕梁市交口县卫明诊所的卫明大夫在冻绿果实采集过程中所提供的帮助。