3种半边莲提取物体外抗猪繁殖与呼吸综合征病毒的作用研究

秦枫，刘云，夏文龙，吴植，吴双，王安平，封琦，王永娟，郭长明，朱善元，吴晓洁

(1.江苏农牧科技职业学院,江苏省兽用生物制药高技术研究重点实验室，江苏 泰州 225300; 2.扬州大学兽医学院，江苏 扬州 2250091)

猪繁殖与呼吸综合征(Porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS)是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)引起的一种急性、接触性、高度传染性疾病，通常表现为母猪的繁殖障碍(如晚期流产、死产和木乃伊)以及新生和断奶仔猪的呼吸系统疾病(如间质性肺炎)[1]，给全球养猪业造成了巨大的经济损失[2]。目前，控制和预防该综合征的主要措施是接种疫苗。灭活苗[3]具有安全、贮存和运输方便等优点，但其免疫次数多、成本较高；弱毒苗[4]具有免疫力强、免疫期长的优点，但其存在污染环境、毒力返强等问题。因此，迫切需要开发新的安全、有效且廉价的抗PRRSV的药物。

在抗病毒研究中，许多中药及其提取物对抗猪繁殖与呼吸综合征都表现出了较强的抑制作用。KIDSADAGON等[5]研究了狗牙根提取物抗PRRSV的体外作用，该研究表明，质量浓度为0.78 mg ·mL-1的狗牙根粗提物可能使PRRSV失活并在体外抑制PRRSV的复制。GAO等[6]调查了隐孔菌子实体提取物是否具有抑制PRRSV感染的能力，结果表明隐孔菌的提取物在体外和体内均抑制PRRSV感染，表明隐孔菌的子实体的水提取物可用作抗病毒治疗剂。冼琼珍等[7]发现板蓝根、黄芪、青蒿、芦根、连翘、穿心莲和夏枯草均具有抗 PRRSV 作用，并且蓝根、黄芪、青蒿和芦根的抗病毒作用较显著。半边莲(LobeliaChinensis)，又称急解索、细米草、蛇舌草，为桔梗科植物半边莲的全草，起载于《滇南本草》，之后李时珍在《本草纲目》中亦有记载，性辛、平，归心、小肠、肺经，其主要含有酚类、生物碱、脂肪酸类、黄酮类和氨基酸等化学成分，具有清热解毒、利尿消肿之功效[8]。李家伟等[9]研究发现，半边莲醇提物及其氯仿萃取物均表现出较好的抗H9N2型禽流感病毒(H9N2 AIV)的作用，并且发现半边莲中的生物碱和黄酮类很可能是其抗病毒活性成分。本研究采用水煎煮法和超声提取法对半边莲进行提取，探讨半边莲水提取物、总黄酮和总生物碱3种不同提取物的体外抗PRRSV的效果，旨在为开发抗PRRSV药物提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 细胞、病毒与中药材

Marc-145细胞、PRRSV SH1705毒株、病毒滴度为105TCID50·mL-1的PRRSV SH1705病毒液、针对PRRSV ORF7编码序列的特异性引物(F:5’-GGGGAATGGCCAGYCAGTCAA-3’,R:5’-GCCAGRGGAAAATGKGGCTTCTC-3’)、拷贝数为4.34×109的pMD-ORF7标准质粒均由江苏省兽用生物制药高技术研究重点实验室保存。中药材半边莲购自于安国药源商贸有限公司。

1.2 主要试剂与仪器

1.2.1 主要试剂 DMEM培养基购自于美国Hyclone公司；细胞用磷酸盐缓冲液(PBS)购自上海源培生物科技股份有限公司；胎牛血清(FBS)、胰蛋白酶购自美国Gibco公司；青链霉素混合液(100倍)、二甲基亚砜(DMSO)购自北京索莱宝科技有限公司；噻唑蓝(MTT)购自西格玛奥德里奇(上海)贸易有限公司，用PBS液配制成2 mg·mL-1,用前新鲜配制。

1.2.2 主要仪器 生物安全柜(MVE公司)，酶联免疫检测仪(Bioteck公司)，CO2培养箱(NVAIRE公司)，ABI 7300(Thermo公司)，倒置荧光显微镜(Olympus公司)，-80 ℃ 超低温冰箱(Thermo公司)

1.3 中药提取

1.3.1 半边莲水提取物的制备 用传统水煎煮法提取半边莲水提液。称取半边莲药材20 g，粉碎至200目，10倍水浸泡过夜，煎煮2次，30 min·次-1，合并滤液，浓缩至浸膏状。

1.3.2 半边莲总黄酮的制备 参照蒋琼凤等[10]的方法并进行改进，使用超声波提取法提取半边莲总黄酮。称取半边莲药材20 g，粉碎至200目，10倍的60%乙醇浸泡过夜，提取温度60 ℃，超声提取2次，30 min·次-1，合并滤液，减压浓缩至浸膏状。

1.3.3 半边莲总生物碱的制备 参照孙尧等[11]的方法并进行改进，使用超声波提取法提取半边莲总生物碱。称取半边莲药材20 g，粉碎至200目，10倍的90%乙醇浸泡过夜，提取温度60 ℃，超声提取2次，30 min·次-1，合并滤液，减压浓缩至浸膏状。

将上述3种浓缩浸膏-80 ℃预冻24 h后，冷冻干燥机干燥，称重，计算得率。

1.4 药物安全性测定

1.4.1 Marc-145细胞培养 取出冻存在液氮中的细胞，立即置于37 ℃ 恒温水浴锅中，不停地摇动使其快速融化。后将该细胞转入含有预热完全的培养基的离心管中，1 500 r·min-1离心，5 min，弃上清液，用预热完全的培养基将其重悬后加入细胞培养瓶中，于5% CO2、37 ℃培养箱中培养[12]，细胞长至单层后进行消化，传代备用。

1.4.2 药物安全性试验 采用MTT法[13]检测药物对细胞的抑制率，测定其在490 nm的光吸收值，根据OD值计算细胞生长抑制率。

将细胞瓶中长至单层的细胞消化后，计数，用含10% FBS的DMEM稀释至约2×105·mL-1，加入96孔板,每孔100 μL细胞悬液。待细胞长至单层后，弃去培养液，第1～10列依次从低质量浓度至高质量浓度加入以安全质量浓度起始的药液，每个浓度重复4孔，每孔100 μL，11～12列加入细胞培养液作为细胞对照，置于 5% CO2、37 ℃培养箱中。培养72 h后，弃去药液，加入MTT溶液(PBS溶解，2 mg·mL-1)，50 μL·孔-1，培养4 h后，弃去MTT溶液，加入DMSO完全溶解结晶，测OD490值。计算公式如下：生长抑制率=(细胞对照组OD490值-药物组OD490值)/细胞对照组OD490值×100%。

1.5 PRRSV病毒滴度测定

1.5.1 PRRSV的扩增 将细胞瓶中长至单层的细胞消化后，弃去旧培养液，用 PBS洗2遍。用含2% FBS的DMEM培养液稀释 PRRSV，接种病毒液至细胞中，于5% CO2、37 ℃培养箱中培养，每天观察，当细胞出现80%～90%病变时，终止培养。将病变细胞在-80 ℃与4 ℃反复冻融3次后，收集细胞悬液，5 000 r·min-1离心5 min，收集上清液[14]，0.22 μm微孔滤膜过滤除菌，分装至EP管内，标注好分装时间与批次等信息后，置于-80 ℃备用。

1.5.2 荧光定量PCR法测定病毒滴度

1.5.2.1 RNA提取及反转录 按照TaKaRa MiniBEST Viral RNA/DNA Extraction Kit的操作说明，从PRRSV SH1705病毒液中提取RNA。将提取得到的RNA依据TaKaRa Prime Script RT Master Mix试剂盒的反应体系，进行反转录，得到cDNA模板[15-17]。同时，将实验室保存的病毒滴度为105TCID50·mL-1的病毒液，提取RNA并进行反转录，并得到cDNA模板。

1.5.2.2 实时荧光定量PCR 取拷贝数为4.34×109的pMD-ORF7标准质粒，配制成浓度为10-1～10-9的稀释液，依次10倍比稀释，共9个浓度梯度，每个浓度设3个重复，作为模板，按照TaKaRa SYBR Premix Ex Taq Ⅱ试剂盒说明书的反应体系配制反应液，将反转录得到的cDNA模板以及稀释好的标准品进行荧光定量PCR反应[18]。

1.6 半边莲提取物体外抗PRRSV的效果测定

1.6.1 阻断作用试验 以各提取物的最大安全质量浓度为起始质量浓度，用含2% FBS 的DMEM培养液2倍比稀释成4个质量浓度梯度，每个浓度梯度重复4孔，PRRSV液稀释度为100 TCID50,另设利巴韦林阳性对照，病毒对照及细胞对照，进行阻断作用试验、抑制作用试验和直接灭活试验。于 5% CO2、37 ℃培养箱中继续培养，每天观察细胞病变(CPE)的情况，待病毒对照组细胞病变程度达到80%～90% 后，用MTT法测各孔OD值，计算细胞保护率[19]。

药物对细胞的保护率=(加药孔OD490值-病毒对照组OD490值)/(细胞对照孔OD490值-病毒对照孔OD490值)×100%

Marc-145细胞在96孔板中长至单层后，弃去旧培养液，加入以最大安全质量浓度为起始质量浓度的药液，每孔100 μL，培养4 h后，弃去药液，加入100 TCID50PRRSV液，每孔100 μL，培养2 h后，弃去病毒液，加入含2% FBS的DMEM培养液。

1.6.2 抑制作用试验 Marc-145细胞在96孔板中长至单层后，弃去旧培养液，加入100 TCID50PRRSV液，每孔100 μL，培养2 h后，弃去病毒液，加入以最大安全质量浓度为起始质量浓度的药液，每孔100 μL，培养4 h后，弃去药液，加入含2% FBS 的DMEM培养液。

1.6.3 直接灭活试验 Marc-145细胞在96孔板中长至单层后，弃去旧培养液，同时加入50 μL药液和50 μL病毒液(使药液最高质量浓度为最大安全质量浓度和病毒液终浓度为100 TCID50)，培养4 h后，弃去药液，加入含2% FBS的DMEM培养液。

1.7 数据处理

上述各组每天用显微镜观察CPE情况并记录，且根据中药对病毒的抑制率评价其抗病毒的效果，抑制率值越高，说明其抗病毒作用越强。采用SPSS19.0软件进行数据统计分析。

2 结果与分析

2.1 半边莲提取物得率

称得半边莲水提取物、半边莲总黄酮、半边莲总生物碱干燥后粉末质量分别为7.18 、5.08 和6.54 g，得率分别为35.9%、25.4%和32.7%。

2.2 半边莲提取物对细胞的安全质量浓度测定结果

细胞病变观察结果发现，不同药物对Marc-145细胞都有着一定程度的毒性作用，并且药物质量浓度越高毒性作用越强，主要表现为细胞折光性增加，变圆、粘连、破碎，甚至脱落。根据公式以OD490值计算药物对细胞的生长抑制率，当抑制率为0时，则表示在该质量浓度下药物对细胞没有毒性作用，从而确定药物的最大安全质量浓度，结果见表1。由表1可知，半边莲水提取物、半边莲总黄酮、半边莲总生物碱和利巴韦林的最大安全质量浓度分别为2.5 、1.25 、0.63 、0.016 mg·mL-1。

注：S、H、G、P分别代表半边莲水提取物、半边莲总黄酮、半边莲总生物碱、利巴韦林。半边莲水提取物、半边莲总黄酮和半边莲总生物碱的起始质量浓度为5 mg·mL-1。利巴韦林的起始质量浓度为1 mg·mL-1。

Note:S,H,G,and P represent the water extract,the total flavonoids,the total alkaloids ofLobeliaChinensisLour,and ribavirin.The initial mass concentration of the water extract,the total flavonoids,the total alkaloids ofLobeliaChinensisLour was 5 mg·mL-1.The initial mass concentration of ribavirin was 1 mg·mL-1.

2.3 PRRSV的TCID50测定结果

实时荧光定量PCR结果显示，已知病毒滴度为105TCID50·mL-1的PRRSV病毒液拷贝数为1.98×108，扩增所得PRRSV病毒液拷贝数为5.27×108，根据拷贝数与病毒滴度对应成比例计算可得，扩增所得PRRSV病毒液滴度为2.66×105TCID50·mL-1。

2.4 半边莲提取物抗PRRSV的药效结果

2.4.1 PRRSV细胞形态观察 各试验组3种作用方式下的PRRSV细胞形态见图1。由图1可知，病毒对照组大部分细胞出现了圆缩、团聚、脱落的现象，而细胞对照组细胞保持单层完好。

从半边莲提取物对PRRSV的阻断作用来看，半边莲水提取物、半边莲总黄酮、半边莲总生物碱和阳性药物利巴韦林处理组均发生了不同程度的病变。半边莲水提取物处理组和半边莲总黄酮处理组病变较明显，PRRSV细胞发生明显圆缩，并伴随有脱落现象，而半边莲总生物碱处理组细胞病变现象较半边莲水提取物处理组和半边莲总黄酮处理组较轻微，PRRSV细胞出现部分团聚现象，但基本保持单层完好。与阳性对照利巴韦林处理组相比，半边莲水提取物处理组和半边莲总黄酮病变现象与其相近，半边莲总生物碱处理组PRRSV细胞基本无病变。

S：半边莲水提取物(2.5 mg·mL-1)；H：半边莲总黄酮(1.25 mg·mL-1)；G：半边莲总生物碱(0.63 mg·mL-1)；P：阳性对照药物利巴韦林(0.016 mg·mL-1)S: Water extract of Lobelia Chinensis Lour(2.5 mg·mL-1); H:Total flavonoid of Lobelia Chinensis Lour(1.25 mg·mL-1); G:Total alkaloids of Lobelia Chinensis Lour(0.63 mg·mL-1); P: Positive control drug ribavirin (0.016 mg·mL-1)

从半边莲提取物对PRRSV的抑制作用来看，半边莲水提取物处理组和半边莲总生物碱处理组出现了明显病变，PRRSV细胞发生圆缩、团聚现象，半边莲总黄酮处理组病变现象轻微，PRRSV细胞出现圆缩现象，但也基本保持单层完好。与阳性对照利巴韦林处理组相比，半边莲水提取物处理组和半边莲总生物碱处理组PRRSV细胞病变程度略微严重。

从半边莲提取物对PRRSV的直接灭活作用来看，半边莲总黄酮处理组有轻微病变现象，PRRSV细胞部分圆缩，但基本保持细胞单层完好，而半边莲水提取物处理组和半边莲总生物碱处理组PRRSV细胞出现了圆缩、团聚及脱落现象，与阳性对照利巴韦林处理组相比，无明显差异。

2.4.2 半边莲提取物对PRRSV的抑制率 MTT检测中药OD490值，当OD490值越高时，说明药物对细胞的保护作用越强，即对PRRSV的抑制作用越强，半边莲3种提取物的抗PRRSV的作用抑制率见表2。

由表2～表4可以看出，阳性对照利巴韦林对PRRSV阻断、抑制和杀灭作用方式下的最高抑制率分别为63.3%、68.9%和65.6%。半边莲水提取物对PRRSV阻断、抑制和杀灭作用方式下的最高抑制率分别为52.1%、60.2%和50.8%，其对PRRSV的抑制作用比其他2种作用方式稍强，但其3种作用方式对PRRSV的抑制率均极显著低于阳性对照利巴韦林处理组(P<0.01)。半边莲总黄酮对PRRSV的抑制和杀灭作用比较强，最高抑制率分别为85.0%、93.9%，与阳性对照利巴韦林处理组相比，其抗病毒效果极显著(P<0.01)，但其对PRRSV的阻断作用较弱，最高抑制率为51.1%，极显著低于阳性对照利巴韦林处理组(P<0.01)。半边莲总生物碱对PRRSV的抑制作用和杀灭作用也具有一定的抗病毒效果，最高抑制率分别为57.8%、58.1%，但其对PRRSV的阻断作用效果较明显，抑制率为91.2%，与阳性对照利巴韦林处理组，对PRRSV的阻断作用极显著(P<0.01)。

表2 不同质量浓度半边莲提取物在阻断作用下对PRRSV的抑制率Table 2 Inhibition rate of PRRSV under blocking effect by different mass concentrations of Lobelia Chinensis Lour %

注：C1、C2、C3、C4分别为对应药物的1、0.5、0.25、0.125倍最大安全质量浓度。*，**表示每列的药物组与利巴韦林对照组的差异显著性分别为P<0.05,P<0.01(增强作用)；a，aa表示每列的药物组与利巴韦林对照组的差异显著性分别为P<0.05,P<0.01(减弱作用)。下同。

Note: C1,C2,C3,and C4 are the maximum safe mass concentrations of 1,0.5,0.25,and 0.125 times of the corresponding drugs,respectively.*,** indicates that the difference between the drug group and the ribavirin control group in each column isP<0.05,andP<0.01 (enhancement),respectively;a,aa indicates that the difference between the drug group and the ribavirin control group in each column isP<0.05,andP<0.01 (attenuated effect),respectively.The same as below.

表3 不同质量浓度半边莲提取物在抑制作用下对PRRSV的抑制率Table 3 Inhibition rate of PRRSV under inhibition effect by different mass concentrations of Lobelia Chinensis Lour %

表4 不同质量浓度半边莲提取物在直接灭活作用下对PRRSV的抑制率 Table 4 Inhibition rate of PRRSV under direct inactivation by different mass concentrations of Lobelia Chinensis Lour %

3 结论与讨论

本试验采用煎煮法和超声提取法2种提取方式对半边莲进行提取，得到半边莲水提取物、半边莲总黄酮和半边莲总生物碱，采用MTT法并结合细胞病变观察，以利巴韦林作为阳性对照，研究了这3种提取物体外对PRRSV的抗病毒作用。研究结果表明，半边莲提取物在体外对PRRSV具有阻断、抑制和杀灭的作用。综合3种作用方式，这3种半边莲提取物均对PRRSV具有抗病毒作用，能给细胞提供较好的保护作用，且半边莲总黄酮抗PRRSV的作用最强，其次是半边莲总生物碱，半边莲水提取物对PRRSV也具有一定的抗病毒作用，但相比较其它2种提取物，其作用效果较弱。

本试验主要采用MTT法来评价中药提取物对细胞的毒性，并采用MTT法计算药物对细胞的最大安全浓度。结果发现，半边莲水提物最大安全质量浓度最高，为2.5 mg·mL-1，说明其对细胞的毒性最小，半边莲总黄酮和总生物碱的最大安全质量浓度分别为1.2、0.63 mg·mL-1。阳性对照药物利巴韦林的最大安全质量浓度为0.016 mg·mL-1，这与赵昕等[20]测定的结果不同，在赵昕的研究中，其所用的利巴韦林的最大安全质量浓度是指在细胞病变为10%的情况下的质量浓度，而本研究中所使用的利巴韦林最大安全质量浓度是指在该浓度下细胞完全无病变。

目前测定病毒滴度的方法有很多，如通过酶联免疫斑点试验、Reed-Muench两氏法、荧光定量PCR等均可获得病毒滴度[21-23]，但是酶联免疫斑点法操作繁琐，而Reed-Muench两氏法耗时较长。荧光定量PCR是目前检测核酸含量以及分析基因表达水平相对变化的主要技术[24]，其准确性高、特异性强、灵敏度高、操作简便，广泛应用于临床医学和生命科学等多个学科领域。本研究采用荧光定量PCR方法检测PRRSV病毒液的病毒载量，根据已知病毒滴度的病毒液，更为快速、准确地得到扩增后PRRSV病毒液的病毒滴度。鞣质、氨基酸、蛋白质、有机酸盐、生物碱盐及苷类等都能被水溶出，这些成分可能具有协同抗病毒的作用，现已有许多研究表明中药水提取物具有很好的体外抗病毒作用。罗聪等[25]研究发现，牛奶菜水提物对中华眼镜蛇毒神经毒性具有抑制作用。黄酮是多种天然药物的活性成分之一，具有抗炎、抑菌、抗病毒、抗氧化等多种活性[26]。目前，已经有大量的研究表明，黄酮具有抗多种病毒的作用，对流感病毒[27]、乙肝病毒[28]、柯萨奇病毒[29]等都有着显著的抗病毒效果。生物碱是生物体内的碱性含氮有机化合物，具有抗菌、抗炎、抗病毒、镇痛、免疫调节等多种药理活性[30]。有研究报道，苦参碱类生物碱具有抗肝炎病毒、柯萨奇B3病毒、流感病毒、巨细胞病毒等病毒的作用[31]。从半边莲3种提取物抗PRRSV的抑制率来看，半边莲水提取物抗病毒效果较弱，对病毒的阻断、抑制和直接灭活作用的最高抑制率分别为52.1%、60.2%、52.6%。半边莲总黄酮对PRRSV的抑制和杀灭作用较强，最高抑制率分别为85.0%、96.0%，但其阻断作用的最高抑制率为51.1%。半边莲总生物碱对PRRSV的阻断作用较强，最高抑制率为91.2%，其他两种作用方式的最高抑制率均低于60%。与阳性对照利巴韦林相比，半边莲总黄酮对PRRSV的抑制和杀灭作用和半边莲总生物碱对PRRSV的阻断作用极显著(P<0.01)。各试验组细胞形态观察发现，半边莲总黄酮在抑制和杀灭病毒作用方式下以及半边莲总生物碱在阻断作用方式下，细胞只出现部分圆缩情况，基本保持细胞单层完好，而半边莲水提取物3种作用方式下均出现了明显的细胞病变。

病毒的增殖过程可分为吸附、穿入、脱壳、基因组转录、基因组复制、基因表达、装配、成熟与释放。在病毒增殖周期中，病毒吸附于宿主细胞表面并与之结合，之后穿过细胞膜进入细胞，在细胞溶酶作用下，脱去衣壳蛋白释放病毒核酸入细胞内，之后进入病毒的生物合成阶段，包括病毒核酸复制和基因表达，最终病毒核酸与蛋白质合成之后，在细胞质内或细胞核内组装成成熟的病毒颗粒。推测半边莲生物碱可能通过阻止病毒颗粒对宿主细胞的吸附过程，增加Marc-145细胞膜的稳定性，而发挥抗病毒作用，半边莲总黄酮可能通过抑制病毒基因组转录和转录的修饰，抑制病毒基因组核酸的复制，以及抑制病毒蛋白质合成及转运等来实现其抑制作用[32-33]。在国内外研究中，至今尚未见半边莲抗PRRSV的报道，但有相关研究证明了其抗其他病毒及抑制肿瘤细胞的作用。李家伟等[9]发现，半边莲醇提物及其氯仿萃取物在体内、体外感染模型都表现出H9N2 AIV活性，并且初步确定半边莲中抗流感病毒的成分很有可能是生物碱。其推测半边莲氯仿萃取物不仅对病毒感染对细胞的吸附有抑制作用外，可能对病毒的复制也有抑制作用，并且推测半边莲醇提物氯仿萃取物中抗病毒活性成分是容易透过细胞膜进入细胞的小分子物质。何珊等[34]研究表明半边莲生物碱对骨髓瘤细胞U266有明显的抑制作用，且其黄酮类的主要成分木犀草素对人宫颈癌细胞和卵巢癌细胞有显著的抑制作用。大量流行病学证据表明，病毒基因能够与正常细胞DNA进行整合，使其逃避宿主免疫系统的监控和清除作用，从而诱发肿瘤。鉴于病毒和癌症较大的相关性，也间接证明了半边莲生物碱和总黄酮可能具有抗病毒作用[35]。

本研究表明，半边莲提取物具有体外抗PRRSV的作用且初步明确了其抗病毒的有效部位。其体内抗病毒研究也有报道，熊菲等[36]发现半枝莲注射液对人工感染鸭病毒性肝炎有较好治疗作用。何恒清等[37]发现半边莲具有防控鸡瘟的效果。杜丽华等[38]研究证明，含有半边莲的中药复方制剂对于治疗宫颈人乳头瘤病毒感染的具有一定的疗效。上述研究表明半边莲及其制剂能防控鸭肝炎、鸡新城疫、人乳头瘤病毒等。