高温处理对粪便大肠杆菌灭杀效果的研究

李含雄 孙 将 袁月祥

（中国科学院成都生物研究所，四川成都 610041）

目前，我国动物粪便年排泄量达38亿吨[1]。大肠杆菌在畜禽粪便中普遍存在，在人畜共患病中是最常见的一种条件致病菌[2]，特别容易引起养殖动物发病[3]。杀灭包含大肠杆菌在内的病菌虫卵，在畜禽粪便无害化与资源化中具有重要意义。常用杀灭大肠杆菌的方法包括高温堆肥[4]、滚筒干燥[5]、厌氧消化[6]等，因大多数种类的大肠杆菌不耐热[7]，高温堆肥是最常用的杀灭病菌虫卵的方法，但其灭杀效果受曝气量、物料C/N、堆体pH值、含水率等堆肥工艺影响。近10余年来，养殖场的养殖方式和堆肥工艺发生了较大变化，但系统性研究高温对畜禽粪便大肠杆菌灭杀作用的报道仍较少。本文系统性地研究了在不同温度下不同处理时间对大肠杆菌的灭杀作用，并在强制好氧堆肥中进行工程验证，阐明高温对大肠杆菌的灭杀规律，进而指导养殖业粪便处理，达到粪便无害化标准[8]。

1 试验材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 培养基

结晶紫中性红胆盐琼脂（VRBA）培养基。

1.1.2 样品采集

新鲜鸡粪取自四川省井研县王村镇养鸡场，鸡粪堆肥样品取自该养鸡场的强制好氧堆肥槽中（该堆肥槽长80 m、宽12 m、高2 m）第1、2、3、5、8、12、16、20、24 d的堆体中，取样时，在该天槽体断面中左、中、右三个点处取样，取样深度距离堆肥表面1 m，取样后冷藏保存。

新鲜猪粪取自乐山沙湾养猪场，猪粪堆肥取自该养猪场的强制好氧堆肥槽中（该堆肥槽长30 m、宽10 m、高2 m）。取样时间点和取样深度同鸡粪堆肥样品。

1.2 槽式堆肥温度测定

在堆肥样品取样点利用长杆水银温度计测定堆体温度，同一地点测定离表面30 cm（表层）和100 cm（中层）2个深度的温度。

1.3 高温处理对大肠杆菌的灭杀试验设计

称取适量新鲜粪便样品充分混匀，然后采用四分法取样装入500 mL广口瓶中，每瓶装100 g样品，分别放入不同培养箱中进行高温处理，温度设置45℃（猪粪无此温度）、50℃、55℃、60℃、65℃、70℃等6个梯度。每隔12 h将广口瓶中粪便混匀后取适量样品进行大肠杆菌计数。每个试验设3个重复。

1.4 大肠杆菌计数

均匀称取10 g样品，装入盛有90 mL无菌水的三角瓶中，摇床振动20 min，使得大肠杆菌均匀分布于无菌水中，将菌悬液进行10倍梯度稀释，选取适宜梯度按照“食品安全国家标准食品微生物学检验大肠菌群计数[9]”的平板计数法进行大肠杆菌计数。

2 试验结果与分析

2.1 高温处理对鸡粪中大肠杆菌的杀灭作用

不同温度处理不同时间后，鸡粪样品中大肠杆菌的数量结果见表1。经过不同的高温处理，鸡粪中的大肠杆菌数量均从2.0×107cfu/g下降到0 cfu/g；55℃及其以上温度处理12 h后可全部杀灭鸡粪中的大肠杆菌，45℃处理则需要72 h才能全部杀灭鸡粪中的大肠杆菌。说明高温处理可全部灭杀鸡粪中的大肠杆菌，且温度越高所需时间越短。

2.2 高温处理对猪粪中大肠杆菌的杀灭作用

不同温度处理不同时间后，猪粪样品中大肠杆菌的数量结果见表2。从表2可知：经过不同的高温处理，猪粪中的大肠杆菌数量均从1.38×107cfu/g下降到0 cfu/g；55℃及其以上温度处理12 h后可全部杀灭猪粪中的大肠杆菌，50℃处理则需要36 h才能全部杀灭猪粪中的大肠杆菌。55℃及其以上温度对猪粪和鸡粪样品中大肠杆菌的灭杀效果一样，均是12 h能全部灭杀。但在稍低温度50℃时，对猪粪样品中大肠杆菌的灭杀效果稍弱，处理12 h时，猪粪中残留大肠杆菌比鸡粪样品多一个数量级，全部灭杀时间比鸡粪样品要长12 h。

2.3 鸡粪好氧堆肥工程中大肠杆菌变化规律

在实验室进行高温处理灭杀大肠杆菌试验的基础上，为了研究实际的高温堆肥工程对大肠杆菌的杀灭作用，采集鸡粪好氧槽式堆肥不同发酵天数的样品来测定大肠杆菌数量，并现场测定该点温度。其结果如图1所示。由图1可知，该槽式堆肥温度从第0 d的14.5℃逐步上升，第1 d达到38℃并维持2 d中温发酵，第5 d达到65℃（中层）～69℃（表层），一直到第16 d均维持在63℃（中层）～58℃（表层）以上，16 d以后温度才逐步下降；且从第5 d开始，堆肥表层温度均明显高于中部温度。

表1 不同高温处理后鸡粪大肠杆菌数量变化 （cfu/g）

表2 不同高温处理后猪粪大肠杆菌数量变化 （cfu/g）

该堆肥场在进料时铺一层鸡粪后加一层辅料和适量的发酵菌种，然后用铲车推高到2 m左右，1 d的原料全部进完后再用翻堆机从尾端开始向后翻耙，使发酵料与新鲜原辅料混匀。本试验中，由于开始物料未充分混匀，且前面3 d物料堆肥地面未铺设曝气管，氧气供应不足，故温度第1 d升到38℃后一直维持到40℃附近；从第4 d开始曝气后，堆体才进入快速升温阶段，第5 d至第16 d均维持在高温阶段，此为快速发酵阶段。16 d后，堆体温度逐步下降到40℃附近，说明堆肥物料中的易利用物质大量消耗，发酵产生的热能不足以维持翻堆、水汽带走的热量。从第5 d开始，表层温度高于中部温度，估计是堆肥底部曝气不足，导致中部没有足够的氧气供发酵菌种利用，而表层疏松度较好，能从空气中补充氧气，从而满足发酵菌种的氧气需求。因此试验采样深度为1.0 m更具代表性。

在此过程中，堆肥中大肠杆菌数量呈指数下降，从第0 d的5.5×107cfu/g快速下降到第3 d的13.7 cfu/g，从第5 d开始堆肥中大肠杆菌的数量一直保持为0。本工程前3 d大肠杆菌的数量快速下降6个数量级，与实验室45℃连续处理72 h可全部灭杀大肠杆菌结果相近。加上随后连续10余天的高温阶段堆体中均没有大肠杆菌，说明正常运行的强制曝气槽式堆肥足以杀灭鸡粪中的病菌虫卵，满足国标的卫生要求[8]。

2.4 猪粪好氧堆肥工程中大肠杆菌变化规律

猪粪好氧堆肥工程中不同发酵天数堆体中大肠杆菌数量和堆体温度如图2所示。由图2可知，前2 d堆体温度从室温逐步上升到40℃，然后又下降到30℃；前5d中层平均温度为35.4℃，表层平均温度为29.9℃；直到第8 d才达到高温阶段，随后温度有所回落，并一直维持在中（中层）高（表层）温附近。咨询该堆肥场，得知采样前几天，堆体运行不太正常，影响了前5 d的升温。加上鼓风机设备异常，堆体中后段曝气不足，导致中部温度明显偏低。工程发酵异常，导致前期堆体中大肠杆菌数量明显偏高。大肠杆菌数量从第0 d的6.2×107cfu/g下降到了第2 d的2.55×104cfu/g，随后到第5 d仍有达到3.85×102cfu/g，第8 d进一步下降到10 cfu/g，第12 d起均下降到0 cfu/g。结合实验室高温杀灭大肠杆菌试验和鸡粪堆肥工程数据可知，当堆肥温度低于40℃时，对大肠杆菌的杀灭作用就很弱。

对比2个好氧槽式堆肥工程，均有一样的翻堆设备，但曝气机运行工况有差异，从而导致2个工程中的堆体温度和大肠杆菌含量均有非常显著的差异。说明在槽式堆肥中，最重要的关键条件是氧气的有效通入，翻堆只能短暂地促进空气交换，翻堆更重要的目的是使物料更均一，曝气才能实现更长、更持续的氧气通入，曝气量对畜禽粪便的无害化有着很大的影响。相比20年前Hima-thongkham等[10]以牛粪高温堆肥大肠杆菌与沙门氏菌第10 d依然还有10%，强制曝气好氧堆肥技术更易实现畜禽粪便的无害化。

3 结论

本次试验研究了不同温度灭杀新鲜畜禽粪便中大肠杆菌的效果，并对大规模的堆肥工程中的大肠杆菌与发酵温度的变化规律进行了研究。结果表明，在45℃下持续处理72 h可有效灭杀畜禽粪便中的大肠杆菌，在堆肥工程中，由于物料均匀度和发酵温度的差异，全部灭杀畜禽粪便大肠杆菌的时间延长到5 d。当发酵温度低于40℃时，对大肠杆菌的杀灭作用很弱。因此需保证堆体中各点的温度均应至少达到40℃以上。强制曝气堆肥工程中，曝气量是比翻堆更重要的关键因素，也是灭杀大肠杆菌等病菌虫卵的关键参数。一个正常运行的好氧堆肥工程能够全部灭杀大肠杆菌。