比色法快速评估饲料中的水溶蛋白及其应用

李 亮 樊福好

（广东省畜牧技术推广总站，广东广州 528300）

饲料中的蛋白质含量是评价饲料营养的重要指标，测定蛋白质的方法有凯氏定氮法（国际经典测定方法）、分光光度法、滴定法等。饲料行业中测定蛋白质最常用的方法是凯氏定氮法，它是测定试样中总有机氮最准确和最简单的方法之一，被普遍作为检验蛋白质的标准方法。但凯氏定氮法无法区分“真蛋白”与其他含氮有机物，在生物蛋白的检测中有一定的局限性，因此，Folin—酚试剂法、Lowry法、考马斯亮蓝法等许多其他的蛋白检测方法也得到了大量研究和发展[1]。

饲料中的有机氮并不能完全被动物利用，仅测定总有机氮无法完全反映饲料的营养价值，所以测定水溶性蛋白的检测方法得到了发展和应用[2]。考马斯亮蓝法是目前实验室中最常见、灵敏度最高的一种测定水溶性蛋白质含量的方法[3]。它将比色法和染料结合法相结合，与Lowry法等其他方法相比，具有所需样品量少、测定速度快、操作简便等优点[4]，适合于大批量、低可溶蛋白样品的测定[5]，被广泛应用于各类生物样品的水溶性蛋白含量测定[6]。该方法还具有干扰物质少的特点，是生物化学、植物生理学等实验课程中的经典实验项目之一。

水溶性蛋白也是评价动物饲料蛋白营养的重要指标之一，尤其是大豆中只有可溶蛋白才能被利用[7]，但一般植物体内水溶性蛋白含量较低[8]，目前对饲料中水溶性蛋白的研究较少[9]，也没有与生长性能关系研究的报道，但也有研究发现，在探索猪的健康快速评价方法时，可应用显色法对饲料蛋白营养进行快速判定[10]。为简化试验方法并推广其在生产中的应用，樊福好参考比色法定义了一个命名为“朊度”的无量纲，即利用微型电子装置发明了便携型检测设备，可发出特定波长的光线，并利用电子感应装置测量溶液透光特性，根据透光特性的变化，在显示屏上显示0～100的数值，规定为“朊度”值。为了评估快速检测技术在生产一线的应用价值，本研究将“朊度”值与721G分光光度计测量值进行了比较和相关性分析，并对小猪饲料的基本营养价值和“朊度”值进行了测量，与部分生长性能指标进行了联合分析，希望为动物饲料的快速、简易评价方法的开发提供参考，增加终端用户对动物饲料的快速评估手段。

1 材料与方法

1.1 试验材料

配制1 mg/mL牛血清蛋白（BSA,Bovine Serum Albumin）溶液，并按 0.125 mg/mL的梯度稀释至0.125 mg/mL；显色试剂和便携型光学检测设备由广州九卦生物科技有限公司提供；721G可见分光光度计由上海精科实业有限公司生产；购买4种市售小猪饲料：甲公司中、低档料分别编号为1、2号，乙公司中档料编号为3号，丙公司中档料编号为4号；随机采样检测其营养成分（见表1）。动物试验选用50～70日龄三元杂阉公猪66头，随机分成A、B、C、D 4个组，其中A组16头，B组16头，C组17头，D组17头。

表1 各饲料主要营养价值分析

1.2 试验方法

取不同浓度的BSA溶液1份加入9份显色试剂中进行显色反应，10 min后分别使用721G分光光度计和便携型光学检测设备测量溶液的吸光度和“朊度”值，并分析其相关性和相对标准误差。取5 g饲料置烧杯中，加45 mL水浸泡20 min后用玻璃棒搅拌，之后静置3 min，取上清液1份加入9份显色试剂，反应10 min，使用便携型光学检测设备测量其“朊度”值。动物试验在广东某规模猪场进行，各组饲养条件一致，密度适中，自由采食饮水，常规饲养管理。试验开始与结束时早晨空腹称重。记录试验期间猪的采食量，计算平均采食量、平均增重、平均末重、料肉比等。

1.3 分析方法

根据测量值计算平均值、相对标准偏差（RSD，Relative Standard Deviation）并进行比较；选择SPSS数据分析软件的单因素ANOVA或非参数检验进行数据分析，并进行S-N-K或Tamhane's T2事后多重比较，结果以“平均数±标准差”表示。使用Pearson进行相关性分析。

2 结果与分析

2.1 吸光值测量结果与分析

测量不同浓度BSA溶液吸光值，同步测量“朊度”值，并进行相关度分析。不同浓度BSA溶液在592 nm的吸光度与对应“朊度”值见表2。分析“朊度”测量值与不同浓度BSA在592 nm的吸光度相关性见表3。通过对每次测量重复10次，并计算其标准偏差（STDEV,StandardDeviation）和相对标准偏差可得表4。

表2 不同浓度BSA溶液在592 nm吸光度和 “朊度”测量平均值

表3 “朊度”与BSA溶液在592 nm吸光度的相关系数

表4 不同浓度BSA溶液10次 “朊度”测量值重复性特征

利用表2的数据，以OD592为X值，对“朊度”（Y） 求回归方程，可得 Y＝80.919X－18.225，2＝0.988，可知回归直线对观测值的拟合程度较好；通过分析二者的相关性（见表3），可知“朊度”测量值与BSA溶液在592 nm处的吸光度有极显著正相关（＜0.01）；通过计算其标准偏差和相对标准偏差可知（见表4），其RSD均小于5%，可以认为仪器测量结果比较稳定可靠。

在实际生产中，饲料企业要测量自有产品的蛋白质含量，一般采用凯氏定氮法，需要花费大量的人力物力和时间；即便近年许多饲料企业采取了近红外光谱法（NIR,Near Infrared）快速测量饲料营养，但由于各地原料、配比各不相同，各企业也要在建立模型、数据库的修正和维护上花费大量的人力物力，上述因素都导致了饲料检测成本较高。此外，工厂的测量数据一般是企业的商业秘密，所取得的数据一般也只是用于生产质控，而不适宜用于营销，更遑论向客户公开。

因此，在养殖生产一线的决策者对饲料蛋白营养价值的了解和判断，都仅限于饲料标签上模糊的范围和业务员口头的承诺，最多也只是采一点样送到机构检测化学成分。对于送检也存在以下3方面问题：①时间差，外检最快也要1个星期出结果，影响决策的及时性；②对于饲料营养价值的实际生物利用价值没有有效判断，如三聚氰胺就是典型的例子；③送检的样品往往还有采样规范性、采样数量、检测成本等多方面的限制，导致检验结果实际应用价值有限，不仅指导生产的作用有限，而且连打官司都不好作为有力证据。因此，对于生产一线的决策者和饲料业务员而言，更需要一种快速、可靠的判断饲料相对营养价值的工具，而“朊度”检测在一定程度上，可以承担这样的任务。

“朊度”检测只需要一点饲料，即可用近乎“零”的成本，在短短20 min内得出一个相对可靠的结论。与传统的在杯子里泡一点饲料，然后观看饲料成分上浮、下沉不同的是：“朊度”测试可以给出一个具体的数字，而且这个数字不仅稳定可靠（RSD＜5%，见表4），还与规范操作的蛋白成分检测数据呈极显著正相关（＜0.01，见表3）。理论上，在生产一线可以利用“朊度”试剂与便携式仪器，对饲料蛋白营养价值快速作出大量可靠的相对性测量，从而为生产决策提供快速可靠的依据。

2.2 饲养试验结果与分析

小猪按组饲喂不同小猪料，A、B、C、D组分别饲喂1、2、3、4号料，饲养时间103 d，结果如表5。计算饲料的“朊度”测量值与生长指标相关性可得表6。

但值得注意的是：因商品饲料的原料来源广泛、配比十分复杂，在某个试验得出的对比结论，可能仅仅只能说明特定时空某几种指定产品的性能差异，并不一定能代表普遍规律。本试验中，因为“朊度”测量值刚好与饲料粗蛋白含量呈现正相关规律，而且受种种因素影响，用于对比的商品饲料所用原料可能比较接近，因此，有时“朊度”值与小猪生长成绩的相关规律也可以解释为粗蛋白含量不同所形成的影响。但不可否认的是，终端用户在短时间内不可能知道商品饲料的实际粗蛋白值含量，在现场进行的“朊度”值测量，可以显著提高用户对饲料质量的快速判断能力。

表5 试验小猪生长数据及饲料 “朊度”测量值均值

表6 “朊度”测量值与生长指标相关性

此外，由于凯氏定氮法检测的是样品中所有有机氮，如果饲料中含有较多角蛋白或其他难溶有机含氮物质时，其“朊度”测量值会相对较低，这也可以在一定程度上反映不同商品饲料中粗蛋白的易消化性差异。

3 结论

参照比色法发明的便携式检测设备所测量的“朊度”值，与721G分光光度计测量值具有极显著线性相关，回归曲线的拟合度较高。分析显示其能够快速且稳定测量一定浓度的饲料可溶性蛋白含量。原料接近的商品饲料饲喂试验证明，使用“朊度”值较高的饲料喂养的小猪生长成绩更好，可以取得更高的经济收益。