淫羊藿通过miR-19a-3p对高糖高脂诱导的胰岛β细胞损伤的影响及机制研究

陈朝琴，薛治乾，李文霞

糖尿病是一种常见的内分泌疾病，影响着全球4亿多人的健康[1]。随着发病率的逐年攀升，糖尿病被视为继肿瘤、心血管疾病之后的位于第三位威胁人类健康的慢性疾病[2]，严重影响病人的生活质量。目前，糖尿病的发病机制尚未完全阐明，但越来越多的证据表明，胰岛β细胞功能受损与糖尿病的发生发展密切相关[3-4]。淫羊藿是小檗科植物淫羊藿、柔毛淫羊藿、巫山淫羊藿、箭叶淫羊藿或朝鲜淫羊藿的干燥地上部分[5]，具益精气、补肾阳、强筋骨、祛风湿之功，用于肾阳虚衰、阳痿遗精、筋骨痿软、风湿痹痛、麻木拘挛[6]。资料显示，以EH、人参、黄精等多种药物配制而成的津力达颗粒对2型糖尿病大鼠胰岛β细胞具有保护作用[7]，黔产粗毛EH、黔岭EH可以改善四氧嘧啶诱发的2型糖尿病模型小鼠胰腺组织损伤[8]，但EH对高糖高脂诱导胰岛β细胞影响方面的研究尚不多见。本研究拟从细胞学水平探索EH对高糖高脂诱导的胰岛β细胞RINm5F损伤的作用及其可能的分子机制，为EH在糖尿病的临床治疗提供新思路，同时也为糖尿病的诊治提供潜在的生物标志物。

1 材料与方法

1.1 实验主要试剂和仪器 胰岛细胞系RINm5F购自美国ATCC细胞库，EH购自上海源叶生物公司，RPMI-1640培养基、胎牛血清购自美国Hyclone公司，棕榈树酸(PA)、葡萄糖、噻唑蓝(MTT)、二甲基亚砜(DMSO)购自美国Sigma公司，RIPA裂解液、聚偏二氟乙烯(PVDF)膜购自美国Millipore公司，miRNA提取试剂盒购自上海Qiagen公司，Tris-HCl-Tween缓冲盐溶液(TBST)购自上海生工生物工程公司，胰酶、凋亡试剂盒购自上海碧云天生物有限公司，逆转录试剂盒、实时定量PCR(aPCR)试剂盒购自美国应用生物系统公司，Lipofectamine 2000购自美国Invitrogen公司，甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)抗体、细胞周期蛋白D1(CyclinD1)、P21、B细胞淋巴瘤/白血病-2(Bcl-2)和Bcl-2相关X蛋白(Bax)抗体购自美国Cellular Signaling Technology公司，辣根过氧化物酶标记二抗购自武汉博士德生物有限公司。细胞培养箱购自美国Thermo公司，7500实时定量PCR仪购自美国赛默飞世尔公司。台式离心机、酶标仪购自德国Eppendorf公司，流式细胞仪购自美国Beckman公司。

1.2 细胞培养及分组 RINm5F细胞复苏后，置含10%胎牛血清的RPMI-1640培养液中，于37 ℃、5% CO2培养箱培养。每24 h更换培养液一次，使用0.25%胰酶进行消化传代。细胞同步化后随机分为对照组(Con组，5 mmol/L葡萄糖)、高糖高脂组(HGL组，25 mmol/L葡萄糖+0.25 mmol/L PA)、低剂量EH组(低剂量EH组，25 mmol/L葡萄糖+0.25 mmol/L PA+10 μmol/L EH)和高剂量EH组(高剂量EH组，25 mmol/L葡萄糖+0.25 mmol/L PA+100 μmol/L EH)。EH干预48 h后进行后续实验。

1.3 qPCR检测miR-19a-3p表达 按照miRNA提取试剂盒说明书的指示，提取RINm5F细胞中总miRNA，使用逆转录试剂盒合成cDNA。以制成的cDNA为模板，U6为参照，采用实时定量PCR试剂盒进行反应。反应条件为95 ℃ 2 min，95 ℃ 15 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 8 min，循环40次，收集Ct值，以2-ΔΔCt法计算miR-19a-3p的相对表达量。

1.4 细胞转染 收集HGL组和不同剂量EH组RINm5F细胞，以1×105个/毫升的密度接种于6孔板，待细胞融合度约为80%时进行转染。根据不同的实验目的，利用Lipofectamine 2000型试剂将miR-19a-3p和anti-miR-19a-3p质粒及相应的阴性对照转染入RINm5F细胞。转染48 h后，收集细胞用于后续实验。

1.5 蛋白印迹法(Western blotting) 采用Western blotting分析各种蛋白的表达情况。收集Con组、HGL组和不同浓度EH组(10、100 μmol/L)RINm5F细胞，加入RIPA裂解液获得总蛋白，用10%的十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(DS-PAGE)分离蛋白，之后将蛋白转移到PVDF膜上，并于5%脱脂奶粉封闭1 h。将膜与相应的一抗4 ℃孵育过夜，加入TBST充分洗涤，与辣根过氧化物标记二抗室温孵育1 h，加入TBST充分洗涤。利用化学发光液中显色、显影，以GAPDH为对照，计算蛋白相对表达量。

1.6 噻唑蓝(MTT)比色法检测细胞增殖 收集各组RINm5F细胞，使用胰酶消化，调整细胞密度为1×104个/孔，接种于96孔细胞板，每组处理设置3个复孔，分别培养24、48、72 h后加入100 μL的MTT溶液(5 mg/mL)，37 ℃孵育4 h，弃上清液，每孔加入200 μL DMSO，37 ℃摇床振荡10 min，在酶标仪490 nm波长处测定细胞吸光值(OD490nm值)。以时间为横坐标，各组细胞OD490nm值为纵坐标，绘制生存曲线。其中，OD490nm值越高，细胞增殖活性越强。

1.7 细胞凋亡实验 各处理RINm5F细胞进入对数生长期后，使用胰酶消化，调整细胞密度为1×106个/毫升，加入500 μL Annexin V缓冲液重悬细胞，随后将细胞转移至EP管，在室温黑暗条件下用5 μL Annexin V-FITC和5 μL PI孵育30 min，上流式细胞仪检测细胞凋亡情况。

1.8 统计学方法 采用t检验、单因素方差分析和q检验。

2 结果

2.1 EH对高糖高脂刺激的RINm5F细胞增殖的影响 MTT对HGL刺激的RINm5F细胞增殖能力检测结果显示，与对照组相比，HGL组细胞增殖活性有所下降，24 h时差异无统计学意义(P>0.05)，48 h和72 h差异有统计学意义(P<0.05)；与HGL组相比，不同浓度EH处理后，RINm5F细胞增殖活性逐渐上升，24 h时差异无统计学意义(P>0.05)，48 h和72 h差异均有统计学意义(P<0.05)(见表1)。

Western blotting检测增殖相关蛋白表达的结果显示，与对照组相比，HGL组细胞中CyclinD1表达量骤减(P<0.05)，P21表达量增加显著(P<0.05)；与HGL组相比，不同剂量的EH组干预后，细胞CyclinD1水平明显提高(P<0.05)，P21水平明显降低(P<0.05)(见图1、表1)。

2.2 EH对高糖高脂刺激的RINm5F细胞凋亡的影响 对HGL诱导RINm5F细胞凋亡和相关蛋白表达的检测结果显示，与Con组比较，HGL作用于RINm5F细胞后，细胞凋亡率大幅增加(P<0.05)(见图2、表2)，Bax表达量明显提高(P<0.05)，Bcl-2表达量明显减少(P<0.05)(见图3和表2)。与HGL组比较，不同剂量的EH处理RINm5F细胞后，细胞凋亡率明显减少(P<0.05)(见图2和表2)，Bax水平有所降低(P<0.05)，Bcl-2表达量增加(P<0.05)(见图3、表2)。

表1 EH对HGL刺激的RINm5F细胞活性及CyclinD1、P21蛋白表达的影响

与Con组比较*P<0.05；与HGL组比较△P<0.05

2.3 EH对高糖高脂刺激的RINm5F细胞miR-19a-3p表达的影响 HGL诱导RINm5F细胞损伤后，细胞中miR-19a-3p表达量明显高于Con组(P<0.05)；加入不同剂量的EH，miR-19a-3p表达水平低于HGL组(P<0.05)，高剂量EH组miR-19a-3p表达量差异最显著(见表3)，故选择高剂量EH组进行后续研究。

分组凋亡率/%BaxBcl-2Con组4.32±0.370.14±0.010.89±0.01HGL组17.25±1.01∗0.76±0.02∗0.29±0.01∗低剂量EH组14.31±1.00△0.62±0.01△0.43±0.01△高剂量EH组10.03±0.58△0.45±0.01△0.57±0.01△F151.8731 222.1431 979.000P<0.010.010.01MS组内0.6230.0000.000

与Con组比较*P<0.05；与HGL组比较△P<0.05

分组miR-19a-3pCon组0.18±0.01HGL组0.75±0.05∗低剂量EH组0.60±0.04△高剂量EH组0.43±0.03△F140.706P<0.01MS组内0.001

与Con组比较*P<0.05；与HGL组比较△P<0.05

2.4 抑制miR-19a-3p表达对高糖高脂刺激的RINm5F细胞增殖的影响 在HGL损伤的RINm5F细胞中转染anti-miR-19a-3p，miR-19a-3p表达明显下调(P<0.01)，说明anti-miR-19a-3p载体成功转染入RINm5F细胞。观察抑制miR-19a-3p表达对细胞增殖的影响显示，抑制miR-19a-3p表达组24 h时的细胞增殖活性无明显变化(P>0.05)，48 h和72 h时，细胞增殖活性显著高于HGL+anti-miR-NC组(P<0.05)，CyclinD1蛋白水平明显高于HGL+anti-miR-NC组(P<0.01)，P21蛋白表达量则显著减少(P<0.01)(见表4、图4)。

2.5 抑制miR-19a-3p表达对高糖高脂刺激的RINm5F细胞凋亡的影响 抑制miR-19a-3p表达较HGL+anti-miR-NC组降低HGL所致的RINm5F细胞凋亡率(P<0.01)和Bax蛋白水平(P<0.01),提升Bcl-2蛋白水平(P<0.01)(见表5、图5)。

2.6 过表达miR-19a-3p能逆转EH对高糖高脂刺激的RINm5F细胞增殖、凋亡的作用 在高剂量EH组RINm5F细胞中转染miR-19a-3p，发现miR-19a-3p表达量高于对照HGL+EH(100 μmol/L)+miR-NC组(P<0.01)。与HGL+EH(100 μmol/L)+miR-NC组相比，过表达miR-19a-3p组48 h和72 h时的细胞增殖能力下降(P<0.01)，细胞凋亡率增加(P<0.01)，同时，CyclinD1和Bcl-2蛋白表达量减少(P<0.01)，P21和Bax蛋白水平提高(P<0.01)(见表6～7、图6)。

表4 抑制miR-19a-3p表达对HGL刺激的RINm5F细胞增殖的影响

分组凋亡率/%BaxBcl-2HGL+anti-miR-NC17.28±1.320.75±0.020.27±0.01HGL+anti-miR-19a-3p12.92±0.920.54±0.020.47±0.02t4.6912.8615.49P<0.01<0.01<0.01

与HGL+anti-miR-NC组比较※P<0.05

3 讨论

EH始载于《神农本草经》，作为补益药，距今已有2 000多年的药用历史[9]。EH是我国传统中药，主要活性成分包括EH苷、EH次苷、EH总黄酮、EH多糖以及一些微量元素等[10]，在心血管、生殖、免疫、骨骼和神经系统等多种疾病的治疗中拥有广泛的应用价值[11]。此外，EH还可降血糖，用于糖尿病及其并发症的治疗[12-14]。糖尿病是由遗传和环境因素综合作用所致，血糖、血脂异常升高是糖尿病重要的临床特征[15]。胰岛的β细胞分泌胰岛素，在整个代谢中发挥着核心作用，而胰岛素是人体唯一能降低血糖的激素，当β细胞分泌胰岛素的能力与机体对胰岛素的需求不匹配，会引发糖尿病，最初，面对胰岛素的抵抗，β细胞会增加胰岛素数量，但随着β细胞功能的下降，最终导致高血糖[16]。β细胞异质性已成为胰岛功能的重要贡献者，对糖尿病产生潜在影响[17]。近年来，有学者[18]利用高糖高脂诱导胰岛β细胞损伤模型，研究糖尿病的相关机制。本实验中，利用胰岛β细胞RINm5F进行研究，以葡萄糖和棕榈树酸构建高糖高脂损伤模型，结果发现高糖高脂刺激的RINm5F细胞增殖活性和Bcl-2表达水平显著低于对照，而细胞凋亡率和Bax表达高于对照，这与张萌等[19]的研究结果一致。另外，高糖高脂增加了细胞中P21表达而降低CyclinD1表达量。不同剂量的EH处理后，细胞增殖能力、CyclinD1和Bcl-2蛋白表达明显高于模型组，细胞凋亡率、P21和Bax蛋白水平则显著低于模型组，说明EH可以减轻高糖高脂对RINm5F细胞的损伤，抑制细胞凋亡。

微小RNAs(MicroRNAs,miRNAs/miR)是一种内源性短链(长度为21～24个核苷酸)非编码RNA，参与细胞分化、增殖和凋亡等过程，影响许多疾病的发生发展，包括糖尿病及其并发症[20-22]。研究[23]表明，miRNA-19a在胰腺癌合并糖尿病病人中表达上调，可作为有效的血清标志物[23]，miR-19a在冠心病合并糖尿病病人循环血中明显高于健康人员[24]，利拉鲁肽对新诊断2型糖尿病胰岛β细胞功能的改善作用可能与血清中miR-19a表达下调有关[25]。本研究中，miR-19a-3p在高糖高脂损伤和不同剂量EH干预的细胞中表达量异常。在HGL损伤的RINm5F细胞转染anti-miR-19a-3p，发现抑制miR-19a-3p表达较相应对照显著提高HGL诱导的RINm5F细胞增殖活性、CyclinD1和Bcl-2蛋白表达，降低细胞凋亡、P21和Bax蛋白水平，与EH对高糖高脂环境中RINm5F细胞的作用结果相似。

表6 过表达miR-19a-3p能逆转EH对HGL刺激的RINm5F细胞增殖、凋亡的作用

表7 相关蛋白的表达

为了进一步观察EH是否通过miR-19a-3p来影响高糖高脂损伤的RINm5F细胞，将miR-19a-3p转染至高剂量EH组RINm5F细胞，发现过表达miR-19a-3p可以逆转EH对高糖高脂刺激下RINm5F细胞增殖、CyclinD1和Bcl-2蛋白表达的促进作用，以及逆转EH对高糖高脂刺激下RINm5F细胞凋亡、P21和Bax蛋白表达的抑制作用。由此可见，EH保护高糖高脂刺激的胰岛β细胞损伤与miR-19a-3p表达有关。

综上所述，高糖高脂会导致胰岛β细胞损伤，影响细胞增殖和凋亡，而EH能够减轻高糖高脂刺激的胰岛β细胞损伤，改善细胞活性，促进细胞增殖能力，抑制细胞凋亡，其作用机制与调节miR-19a-3p表达有关。这将为EH和miR-19a-3p在糖尿病中的运用提供理论参考。