黑土长期不同施肥处理土壤Hu的光谱学特征

张久明， 刘亦丹， 张一雯， 迟凤琴*， 魏 丹， 周宝库，宿庆瑞， 匡恩俊， 郝小雨， 孙 磊

1. 黑龙江省农业科学院土壤肥料与环境资源研究所， 黑龙江省土壤环境与植物营养重点实验室， 黑龙江 哈尔滨 150086 2. 黑龙江省农业科学院博士后科研工作站， 黑龙江 哈尔滨 150086 3. 北京市农林科学院植物营养与资源研究所， 北京 100097 4. 东北农业大学资源与环境学院， 黑龙江 哈尔滨 150030

引 言

土壤腐殖质是土壤有机质的重要组成部分， 作为养分源主要是C源和N源， 在土壤肥力， 环境保护和农业可持续发展等方面具有重要作用。 土壤腐殖物质三组分即胡敏酸(HA)、 富里酸(FA)和胡敏素(Hu)， 其中Hu是与无机矿物紧密结合、 任何pH条件的水溶液中都不溶解的腐殖物质组分[1]。 Hu占有土壤有机碳含量的50%以上[2]， 在腐殖质中是重要的组成部分， 不论是维持土壤结构、 保持土壤养分， 还是调节土壤的营养元素循环， 对营养元素固持和有效性， 以及在土壤肥力和生态环境等方面起着重要作用。 差热分析是热分析中最成熟和应用最广泛的技术， 它是一种在程序控制温度下， 测量样品与参比物之间温度差与温度关系的方法[3]。 随着现代仪器分析方法及手段的发展，13C-核磁共振(13C-NMR)波谱、 红外光谱、 荧光光谱等分析技术更多的运用到腐殖质结构的分析[4-5]。 以农业部黑龙江耕地保育与农业环境科学观测试验站为平台(39年黑土定位施肥试验)， 结合差热分析、 傅里叶变换红外光谱、 核磁共振波谱现代分析技术手段， 从物质结构的角度对比分析黑土长期定位试验典型施肥处理土壤Hu分子结构变化特征， 为黑土长期培肥提供理论依据。

1 实验部分

1.1 试验地点基本情况

黑土肥力长期定位监测试验站1979年建立， 位于中国黑龙江省哈尔滨市(E126°51′28″， N45°50′37″)， 海拔151 m， 属松花江二级阶地。 土壤为发育于黄土状母质上的中层黑土， 黑土层厚度为50 cm， 质地为壤质。 气候属中温带大陆性季风气候， ≥10 ℃年平均有效积温2 700 ℃， 年降雨533 mm， 无霜期135 d。 试验站共24个处理， 本研究选取其中CK， NPK， M和MNPK四个施肥处理， 3次重复， 每个小区面积36 m2， 1979年定位试验之前种植作物为小麦， 基本养分性状见表1。 长期定位试验采用小麦(1980年)-大豆-玉米轮作方式， 在不同作物年份施肥用量见表2。 有机肥为纯马粪， 按纯氮量75 kg·hm-2(约马粪18 600 kg·hm-2)施用， 每轮作周期玉米收获后施入。 马粪中有机碳(C)、 氮(N)、 磷(P2O5)和钾(K2O)含量分别为163.6， 5.8， 6.5和9.0 g·kg-1。 氮、 磷、 钾肥均为秋季施肥(玉米季氮肥50%秋施， 50%于大喇叭口期追肥)， 氮肥为尿素(N 46%)， 磷肥为重过磷酸钙(P2O546%)， 钾肥为硫酸钾(K2O 50%)。

表1 供试土壤基本性质(1979年)

注： 1979年9月采集土样测定结果

Note: Results of soil samples collected in September 1979

注： CK表示不施肥； NPK表示施氮磷钾化肥； M表示施有机肥； MNPK表示有机肥配施氮磷钾化肥(下同)

Note: CK means no fertilization; NPK means nitrogen, phosphorus and potassium fertilizers applied; M means organic fertilizer applied; MNPK means organic fertilizer with nitrogen, phosphorus and potassium fertilizers applied (the same below)

1.2 土壤样品采集

选取长期定位试验对照不施肥(CK)， 有机肥(M)， 无机肥氮磷钾配施(NPK)， 有机肥与无机肥氮磷钾配施(MNPK)。 土壤样品采集于2012年秋(玉米)， 采用S型取样， 共取5点， 采集深度为0～20 cm。

1.3 测定项目与方法

1.3.1 土壤Hu的提取与纯化

称取过0.25 mm的风干土样10 g于100 mL离心管中， 加80 mL蒸馏水提取24 h离心后弃去上清液， 上述方法进行2次。 向离心管中加入80 mL的0.1 mol·L-1NaOH溶液， 24 h后离心得到腐殖质(HE， 可用于提取FA和HA)， 重复此方法直至提取液颜色很浅为止。 离心管中的残渣依次用体积比为0.5%， 2.5%， 5%， 10%， 20%， 30%和40%的HCl-HF混合液分别处理7， 7， 11， 6， 4， 2和1次， 每次间隔12 h。 如经过以上步骤处理后还有沙粒没有洗净， 可适当用20%的混合酸再洗几次， 最后用蒸馏水洗至无Cl-反应(AgNO3检验)， 再经冷冻干燥， 得到纯Hu[5]。

1.3.2 测试及分析仪器

(1)固体有机碳采用总有机碳分析仪(TOC)测定。

(2)红外光谱(IR)分析应用美国NICOLET-EZ360红外光谱仪， 扫描范围为4 000～400 cm-1， 采用KBr压片法测定。 将待测有机质样品经真空冷冻干燥后， 粉碎研细到小于2 μm， 然后分别用微量或半微量天平称取土壤有机质样品和KBr粉末， 并以样品∶KBr=1∶200的比例， 在玛瑙研钵中混磨后压片。 以4 000， 2 000和860 cm- 1处作为零吸收点， 将通过3点的直线作为基线， 进行吸收强度的测定， 并加以比较。 测定时， 仪器的分辨率设为4 cm-1。

(3)热性质分析采用日本岛津TA-60型差热分析仪测定， 并应用仪器自带软件对各样品进行差热分析(differential thermal analysis， DTA)和热重分析(thermogravimetric analysis， TG或TGA)；

(4)固态13C核磁共振波谱采用瑞士BrukerAV400型核磁共振仪测定， 运用交叉极化魔角自旋(CPMAS)技术，13C 共振频率为400.18 MHz， 魔角自旋频率为8 kHz， 接触时间为2 ms， 循环延迟时间为3 s， 数据点为3 000个， 化学位移用外标2，2-二甲基-2-硅戊烷-5-磺酸钠(DSS)校正， 积分面积由仪器自动给出， 各类型碳相对含量用某化学位移区间积分面积占总积分面积的百分数表示。

1.3.3 数据统计分析

红外光谱分析采用Nicolet Omnic 8.0专业软件， 核磁共振波谱(CPMAS13C-NMR)采用MestRe Nova专业软件分析。 经过分析提取源数据后采用Microsoft Office Excel 2010和Origin 8.0 软件进行数据处理和绘图， Origin绘图将“Available Data”中数据以拟合曲线叠加方式进行绘制， SPSS 19.0统计分析软件对数据进行差异显著性检验(邓肯法)相关分析。

2 结果与讨论

2.1 长期施肥下黑土腐殖质组分Hu碳及有机碳含量

结果表明(表3)， MNPK， M和NPK施肥处理土壤有机碳含量为14.79， 14.50和14.39 g·kg-1， 较CK处理分别提高19.2%， 16.8%和16.0%， 各施肥处理与CK差异显著(p<0.05)。 表明无论是有机无机肥配施还是单施有机肥和单施化肥较不施肥处理均提高土壤有机碳含量， 但以有机无机肥配施增加效果最为显著。 黑土不同施肥措施使土壤Hu的含量在处理间的高低变化有所不同， 各处理的土壤Hu平均含量大小顺序为NPK>CK>M>MNPK， 处理之间差异不显著(p<0.05)。 土壤Hu占有机碳的比值显示， 各施肥处理均较CK处理下降， 其中MNPK施肥处理最低， NPK施肥处理高于施有机肥处理。

表3 不同施肥处理黑土Hu碳及有机碳含量

Table 3 Hu carbon and organic carbon content in black soil under different fertilization treatments

年份/土层处理Hu碳提取量/(g·kg-1)有机碳/(g·kg-1)占有机碳/%CK6.65±0.4a12.41±0.11b53.592012年NPK6.88±0.3a14.39±0.12a47.81(2012)M6.64±0.4a14.50±0.20a45.79MNPK6.35±0.3a14.79±0.18a42.93

注： 不同小写字母表示不同施肥处理间差异显著(p<0.05)(下同)

Note: different lower-case letters indicate significant differences among different fertilization treatments (p<0.05) (the same below)

2.2 长期施肥下黑土胡敏素的热性质分析

土壤Hu的差热分析DTA曲线显示： 黑土不同施肥处理都出现低温吸热峰， 中温和高温放热峰。 低温吸热峰出现在65 ℃， 中温放热峰在340～345 ℃之间， 高温放热峰在485～515 ℃之间。 MNPK和NPK施肥处理土壤Hu的中温放热峰温较高为345 ℃， 高温放热峰温M处理最高为515 ℃， 其次CK处理为500 ℃。

图1 不同施肥处理黑土Hu的DTA曲线

从半定量积分数据的结果(表4)来看， 不同施肥处理土壤腐殖质组分Hu反应热存在一定的差异。 M， NPK和MNPK施肥处理较CK处理总反应热增加， 较CK处理分别提高9.7%， 2.1%和0.6%， 因此可以初步说明M和NPK施肥处理中土壤Hu能够分解的有机质含量较高。 中温放热值代表土壤Hu脂肪族结构含量的高低， M， MNPK和NPK施肥处理较CK均有不同程度增加， M施肥处理增加最多， 提高27.9%， 其次是MNPK施肥处理提高6.7%； 各施肥处理高温/中温值大小为NPK>CK>MNPK>M， 代表NPK和CK处理土壤腐殖质组分Hu分子中的芳香结构较多。

表4 不同施肥处理黑土Hu的反应热

2.3 长期施肥下黑土Hu的FTIR特征

从表5可看到： 与CK处理相比， 2 920/1 620其比值的高低顺序为MNPK>M>CK> NPK， 表明单施有机肥和有机无机肥配施均可提高土壤Hu的2 920/1 620比值， 其脂族性增强， 芳香性减弱。 不同施肥处理土壤Hu的2 920/2 850值的高低顺序为M>NPK>MNPK>CK， 表明施肥可以增加土壤Hu分子中脂族链烃的比例， 单施有机肥增加比例最高。

2.4 长期施肥作用下黑土胡敏素的CPMAS 13C-NMR波谱特征

图3为Hu的固态CPMAS13C-NMR波谱， 可划分为四个主要的共振区， 即烷基C区(0～50 ppm)、 烷氧C区(50～110 ppm)、 芳香C区(110～160 ppm)和羰基C区(160～200 ppm)[6]。 年际间不同施肥处理中黑土Hu的烷基C吸收峰主要在29～30 ppm最为明显， 是长链烷烃或环烷烃结构中的亚甲基C。 Hu的烷氧C吸收峰主要在73 ppm附近， 归属为碳水化合物C的吸收。 芳香C区中， 128～132 ppm主要是苯环基碳C， 单宁和木质素； 羰基C区中， 主要信号出现在170～172 ppm， 为酯和酰胺C的吸收[7]。

图2 不同施肥处理黑土Hu红外光谱

表5 不同施肥处理黑土Hu的IR光谱主要吸收峰的相对强度/cm-1(半定量)

注： 2 920/1 620比值为2 920+2 850处面积与1 620处面积的比值； 2 920/2 850比值为2 920处面积与2 850处面积的比值

Note: the value of 2 920/1 620 is the ratio of (2 920+2 850) area to 1 620 area; the value of 2 920/2 850 is the ratio of 2 920 area to 2 850 area

图3 不同施肥处理黑土腐殖质组分Hu的CPMAS 13C-NMR波谱

Fig.3 CPMAS13C-NMR spectra of humus fractions Hu from black soil under different fertilization treatments

烷氧碳主要来源于半纤维素、 纤维素、 聚合和非聚合的碳水化合物或类乙醇物质， 代表易被微生物代谢利用的碳水化合物， 即易分解碳。 通常烷基C/烷氧C比值是评价土壤有机碳分解程度的敏感指标， 可用来反映腐殖物质烷基化程度的高低， 其比值越小说明有机质的分解程度越低。 芳香碳主要来源于木质素、 软木质、 多肽类或黑碳等带有苯环类的物质， 也可能来源于微生物代谢产物或植物体经过高热产生的物质， 它常和烷基碳一起， 用来表征难被微生物利用的碳化合物， 即难分解碳。 为了更简明阐述土壤Hu的结构变化， 将各类型C的比值进行分析， 结果表明(表6)， 不同施肥处理较CK土壤Hu的烷基碳/烷氧C比值均增加， NPK施肥处理提高30.3%， 幅度最大。 各施肥处理中土壤Hu的疏水C/亲水C比值MNPK施肥处理提高6.6%， 幅度最大； NPK施肥处理土壤Hu的疏水C/亲水C比值较CK降低。 施入有机肥处理明显增加土壤Hu的疏水C/亲水C比值， 以MNPK施肥处理最高， NPK施肥处理最低， 差异显著。 说明有机无机肥配施可以提高土壤有机碳稳定性， 而单施化肥处理有机质分解程度增加， 稳定性较CK降低。

表6 不同施肥处理黑土Hu的固态CPMAS13C-NMR不同类型C分布

Table 6 Solid state CPMAS13C-NMR C distribution in black soil Hu under different fertilization treatments

处理烷基C/烷氧C疏水C/亲水C2012年CK0.76±0.01b1.51±0.05cNPK0.99±0.05a1.49±0.12cM0.94±0.02a1.55±0.09bMNPK0.89±0.03b1.61±0.11a

注： 疏水C/亲水C=(烷基C+芳香C)/(烷氧C+羧基C)

Note: Hydrophobic C/hydrophilic C=(alkyl C+aromatic C)/(alkoxy C+carboxyl C)

3 结 论

以往学者对土壤腐殖质组分结构的研究从单一的方法， 逐渐向多种光谱学技术的联合应用进行发展， 随着现代仪器分析方法及手段的运用，13C-核磁共振(13C-NMR)波谱、 红外光谱、 荧光光谱等分析技术更多的运用到腐殖质结构的分析当中[8]。 土壤腐殖质的研究更多的是关注土壤和水污染修复[9-10]， 以及分析不同类型土壤或某一时间不同施肥方式对土壤腐殖质组分含量和组分结构的变化， 但系统轮作条件下长期施肥后腐殖质Hu组分含量和结构变化规律研究较少。

热性质分析可以表征土壤Hu可分解有机质含量多少， 本研究结果显示， M和NPK施肥处理中土壤Hu能够分解的有机质含量较高。 红外光谱可以定性分析其脂族性强弱， 结果显示M和MNPK处理均可提高土壤Hu的2 920/1 620比值， 其脂族性增强， 芳香性减弱。13C核磁共振波谱可以半定量分析其各类型碳含量， 结果显示有机无机肥配施可以提高土壤有机碳稳定性， 而单施化肥处理有机质分解程度增加， 稳定性较CK降低。 虽然不同施肥方式可以增加土壤Hu碳含量， 但占土壤总有机碳比重降低。 表明土壤总有机碳增加是由于土壤腐殖质不同组分相互累加而导致， 不是受土壤腐殖质单一组分变化决定。

本研究表明有机无机肥配施可以最大程度提升土壤碳库容量， 土壤Hu的脂族性增强， 提高土壤有机碳稳定性， 并同时证明多种光谱学技术的联合应用可以更加准确的反应腐殖质组分结构的变化特征。