牛磺酸对宫内生长受限孕鼠生长轴激素与基因的影响

李平丽，吴骁，杨建成

(1. 沈阳农业大学畜牧兽医学院，沈阳 110866； 2. 辽宁何氏医学院动物实验中心，沈阳 110163)

宫内生长受限(IUGR)是妊娠期最常见的营养缺乏性疾病。 其围产儿死亡率为正常儿6 ～10 倍，IUGR 可导致早产，子代低出生体重和小于胎龄儿的发生[1]。 胎儿接收到的营养供给与母体息息相关，当各种原因导致母体摄入的营养受到限制时，随之到达胎儿的营养也会相应减少，引发胎儿生长受到限制[2]。 IUGR 是国内外发育的主要研究热点之一，但目前尚无明确药物或方法解决。 牛磺酸(Taurine)是一种条件性必需氨基酸，可以维持细胞膜稳定，增强机体抗氧化能力，提高人类和动物繁殖性能等[3]。 牛磺酸已经被当做饲料添加剂广泛应用于动物生产中，在维持动物机体的正常生理功能以及增强机体生产性能等方面都发挥着重要的调节作用[4]。 牛磺酸对胎儿及新生儿生长发育以及中枢神经系统具有重要作用，围产期补充牛磺酸可以减少胎儿生长受限的孕妇怀孕期间由于牛磺酸缺乏引起的新生儿出生体重降低等并发症的发生率。 因此，我们推测牛磺酸可能具有改善母体营养的作用。 本文拟采用低蛋白饮食制备IUGR 模型，考察牛磺酸对孕鼠的影响，揭示牛磺酸改善IUGR 的机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物

SD 大鼠60 只，SPF 级，其中雄性20 只，雌性40只，所有的实验动物均为8 周龄，体重200 ～250 g，购置辽宁长生生物技术有限公司【SCXK(辽)2015-0001】，饲养于沈阳绿谷生物技术产业有限公司动物实验室【SYXK(辽)2015-0007】。 雌雄2 ∶1合笼饲养，第二天清晨取各组实验动物的阴道分泌物并用显微镜进行观察，当发现精子时记为该实验动物的孕1 d，显微镜观察以后，将同一时间发现阴道分泌物中有精子的实验动物分组，不限饮水，饲料均由沈阳茂华生物科技有限公司【SCXK(辽)2017-0001】提供。 室温控制在20 ～25 ℃，湿度40% ～70%，12 h 昼夜交替照明。 所有操作均符合沈阳绿谷生物技术产业有限公司的实验伦理要求(审批号：IACUC 2015007)。

1.1.2 试剂和仪器

牛磺酸(纯度＞99%)，购自潜江永安药业股份有限公司(批号：SXP17013068)。 生长激素(GH)、胰岛素(INS)、胰岛素生长因子(IGF-1)、三碘甲状腺原氨酸(T3)、甲状腺素(T4)(均购自伊莱特生物科技股份 有 限 公 司，批 号 分 别 为：AK0018FEB26010、AK0018FEB26018、AK0018FEB26008、AK0018FEB25021、AK0018FEB250171)。 50 × TAE Buffer、1 × TE Buffer批号：C615KA3D123KA4804)，购于上海生工生物工程股份有限公司；RNA 提取试剂TRIzol(批号：Q5322)，购于沈阳海灵兴业商贸有限公司；DL 2000 DNA Maker(批号：A2510)、PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser(批号：AAK4802)、Free-water(批号：AHF2302A)、SYBR Premix Ex Taq II(批号：A5602)，购于沈阳海灵兴业商贸有限公司。

酶标仪(Infinite M200 PRO，TECAN 公司)；HE120 型水平式电泳槽(上海天能科技有限公司)；DHP-9162 型生化培养箱(上海一恒科技有限公司)； 高 速 冷 冻 离 心 机( AllegraX - 22 型，BECKMANCOMLT 公司)；GelDoc XR 凝胶成像系统、S1000PCR 扩增仪、iQ5 荧光定量基因扩增仪(Bio-Rad，美国)。

1.2 方法

1.2.1 实验处理

取健康SD 系大鼠雌雄2 ∶l 合笼饲养，按妊娠顺序随机抽取孕鼠分为正常饲料组(C)、低蛋白饲料组(M)、低蛋白饲料+牛磺酸组(MT)，正常饲料+牛磺酸组(T)。 动物模型建立参照文献[5]并加以改进，采取全程低蛋白饮食法建立IUGR 模型。 自受孕第1 ～21 天，C 组大鼠予标准饲料(能量比例构成：蛋白质20%、碳水化合物60%、脂肪4%，其他16%)，IUGR 组和MT 组予低蛋白饲料(能量比例构成：蛋白质8%、碳水化合物60%、脂肪4%，其他28%)；MT、T 组自受孕第12 天起口服添加牛磺酸300 mg/(kg·d)至第21 天。 整个饲养过程中采取自由摄食，饮水充足。 孕第21 天，取胎鼠，称重、记录出生只数，胎鼠畸胎数，取孕鼠血液、肝，Elisa 方法检测孕鼠血清生长激素(GH)、胰岛素生长因子1(IGF-1)、胰岛素(INS)、甲状腺素(T3 和T4)水平。肝立即置于-80 ℃冰箱，冻存待检。 提取组织RNA时，按RNA 提取试剂盒说明书提取。 确定总RNA样本质量和浓度，以500 ng 总RNA 为范本，按反转录试剂盒说明书合成互补脱氧核糖核酸(complementarydeoxyribonucleicacid，cDNA)。 q-PCR的反应体系20 μL：SYBR Green I RCR buffer 10 μL，上下游引物各0.8 μL，cDNA 模板2 μL，ddH2O 6.4 μL，每个样本均做3 个复孔。 反应条件：95 ℃预变性2 min，95 ℃30 sec，引物退火温度55 ℃45 sec，72 ℃45 sec，共40 个循环。 根据2-△△Ct对基因表达进行相对定量分析。

1.2.2 目的及内参引物设计

NCBI 网站搜索GenBank 中已有的大鼠GHR、IGF-1、IGFBP-1 和IGFBP-3 基因序列设计相应引物，以GAPDH 为内参基因，引物由上海生物工程股份有限公司合成。 (见表1)

1.3 统计学分析

使用SPSS17. 0 软件进行统计数据，使用Graphpad Prism 5 软件作图。 两组数据之间差异性用t检验的方法进行分析，使用单因素方差分析多组数据之间的差异性，最终的计量数据采用平均值±标准差表示(±s)。P＜0.05 表示差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 各组新生仔鼠数量、体重、死胎、畸形和IUGR发生率的测定结果

通过表2 各组数据可以表明IUGR 造模是否成功。 如表2 所示，与C 组相比，M 组新生仔鼠平均数量显著减少(P＜0.05)，平均体重极显著下降(P＜0.01)，死胎率分别为16.42%(P＜0.01)，畸形率为1.50%(P＜0.05)。 与M 组相比，MT 组新生仔鼠平均数量增加，但无显著性差异(P＞0.05)，平均体重显著升高(P＜0.05)，死胎率和畸形率均降低显著(P＜0.05)。 MT 和T 组均无死胎和畸形胎；IUGR 以低于空白胎鼠平均体重2 个标准差为标准，计算IUGR 发生率[1-2]。 与C 组相比，M 组IUGR 发生率显著增加，与M 组相比，MT 组IUGR 发生率减少。 实验结果表明给怀孕的母鼠补充牛磺酸可以明显降低新生仔鼠的死胎率与畸形率。 T 组与空白组比较，胎鼠平均体重显著增加，IUGR 发生率则明显减少，表明牛磺酸对正常营养出生胎鼠生长有促进作用。 (见表2)

表1 PCR 引物序列Table 1 PCR primer sequence

表2 新生仔鼠数量、体重、死胎、畸形和IUGR 发生率测定结果Table 2 Number，weight，stillbirth，malformation and incidence of IUGR of newborn rats in each group

2.2 各组孕鼠妊娠期体重增长

妊娠期1 ～7 d，各组孕鼠体重均增加，各组增重无差异。 第7 ～14 天，M 组增重略低，但差异不显着(P＞0.05)，MT 组与M 组差异显着(P＜0.05)，第14 ～21 天，M 组增重与C 组相比极显着(P＜0.01)，MT 组增重与M 组相比差异极显着(P＜0.01)，T 组与对照组相比增长迅速(P＜0.01)。(见表3)

2.3 各组孕鼠妊娠期末血液变化

妊娠期末，M 组血清中GH、INS 和T4 浓度与C组相比均降低，其中GH 和T4 降低显着(P＜0.05)，INS 降低极显着(P＜0.01)。 MT 组血清中GH、IGF-1、T3 浓度与M 组均有升高趋势，INS、T4升高显着(P＜0.05)。 T 组GH、IGF-1、T3 浓度与C组相比均升高，GH 升高极显着(P＜0.01)，IGF-1、T3 升高显着(P＜0.05)。 (见表4)

2.4 各组孕鼠肝生长激素受体(GHR)、胰岛素生长因子1(IGF-1)、胰岛素生长因子结合蛋白1(IGFBP-1)和胰岛素生长因子结合蛋白3(IGFBP-3)mRNA 表达水平变化

妊娠期末，M 组大鼠肝GHR、IGF-1、IGFBP-3 mRNA 表达量降低，IGFBP-3 下降显著(P＜0.05)，IGFBP-1 表达明显升高(P＜0.01)。 MT 组GHR、IGF-1、IGFBP-3mRNA 与M 组比较均升高，但GHR 升高不显着(P＞0.05)。 与C 组相比，T 组GHR、IGF-1、IGFBP-3mRNA 均 升 高，IGFBP-3 升 高 极显 着(P＜0.01)IGFBP-1 表达下降(P＜0.05)。 (见图1)

3 讨论

IUGR 的发生与母体摄入的营养有关密切关系，各种引起母体摄入营养受限的因素都有可能导致IUGR 的发生，进而导致围产期胎儿高发病率与高死亡率[7]。 本实验采用低蛋白营养制备IUGR 模型，出生胎鼠数量、体重、死胎、畸形方面结果显示，模型制备成立，牛磺酸无论对低营养或者正常营养的胎鼠，均有促进生长作用。

表3 各组孕鼠体重增长情况比较(g)Table 3 Comparison of weight growth of pregnant rats in each group (g)

表4 各组孕鼠妊娠期末血液学参数比较Table 4 Comparison of hematological parameters at the end of pregnancy in each group of pregnant rats

图1 孕鼠肝GHR、IGF-1、IGFBP-1 和IGFBP-3 mRNA 相对表量Note. NS meansP＞0.05.n=10.Figure 1 Relative expression of GHR，IGF-1，IGFBP-1 and IGFBP-3 mRNA in liver of pregnant rats

母体内分泌激素通过调节代谢而影响胎儿的生长发育，胚胎的生长发育主要受内分泌生长轴的调控，其中GH/IGF-1轴是动物实现营养代谢及促进生长的关键[8]。 本试验，由于妊娠期营养物质较低，营养受限母体血液中GH 和INS 浓度显着下降，子代发生IUGR，与Berends 等人的实验结果一致[9-13]。 母体在孕期时如果营养受到限制，则将直接影响到出生子鼠。 例如饲料中的蛋白质水平无法满足正常的需要，那么母体中的血液胰岛素水平将会急剧的降低，进而加快脂肪分解，母体的血糖也会随之升高。 低浓度的INS、IGF-1 通过调节母体的代谢，加强其组织蛋白质的分解效率，最终导致新生仔鼠体重下降以及发育迟缓等一系列并发症的出现[14]。 甲状腺激素分泌不足可导致胎儿神经系统发育障碍，严重者可出现呆小症[15]。 临床数据显示，妊娠不良结局的发生与甲减关系密切[16-17]。IUGR 脐血T4 水平较正常组显著下降，IUGR 孕妇体内存在甲状腺功能减低的现象，提示上述结果可能与胰岛素分泌不足影响甲状腺素的代谢有关[18]。本实验中结果显示牛磺酸能够提高IUGR 孕鼠INS、T4 水平。 综上我们推测，补充牛磺酸提高出生重，除了影响GH/IGF 轴外，也可能与增加胰岛素分泌有关。

营养受到限制，母体可通过调节其体内生长轴相关素与其受体基因的表达而影响动物的生长，肝中GHR、IGF-1 等是内分泌生长轴的重要组成部分，是肝代谢变化的重要调节因子[19-20]。 此外，营养摄入低不仅会抑制肝细胞GHR 和IGF-1 基因的表达还会降低血液中IGF-1 水平。 杨美霞[16]发现低营养妊娠母羊肝IGF-1 基因表达量极显著低于自由采食。 GHR 的减少抑制了IGF-1 的生成，母体血中IGF-I 浓度降低。 当然，这也与营养受限后胰岛素浓度降低有关。 IGF-1 可以通过其结合蛋白调节自身的生物活性，IGF-1 主要有IGFBP-1 和IGFBP-3 两种结合蛋白，其表达与营养调控有关，在循环血液中，IGF-1 的活性受IGFBP-1 影响，主要是抑制其活性，而IGF-1 的输作用主要由IGFBP-3 完成[21]。 在本实验中，IUGR 组GHR、IGF-1 的mRNA 表达量均降低，IUGR 孕鼠IGFBP-1 的mRNA 水平显着升高，而IGFBP-3 mRNA 水平显着降低，表明营养不良大鼠体内存在GH/IGF-l 系统紊乱。 补充牛磺酸组的IGF-1/IGFBP-3 mRNA 水平明显升高，T 组IGFBP-3极显著升高，表明牛磺酸可以从直接和间接两方面发挥作用。 它不仅可以直接促进IGF-1 的表达，还可以通过调节IGF 结合蛋白的表达间接发挥作用，通过一系列途径发挥改善IGF-1 的生物学活性的作用。 补充牛磺酸组还可降低IGFBP-1 水平，间接增加游离IGF-1 水平及活性，提示牛磺酸可通过纠GH/IGF-1 系统的功能紊乱，达到改善孕鼠营养的作用。

综上所述，本次实验营养不良大鼠循环内甲状腺、GH/IGF-1 轴紊乱，而牛磺酸可纠正GH/IGF-1系统功能紊乱，改善胎儿生长作用。 但因GH/IGF-1系统与胎儿体内激素水平并无定论，所以，关于牛磺酸对IUGR 的作用，仍需进一步研究。

致谢：感谢国家自然科学基金的资助。