不同条件下建立过敏性结膜炎小鼠模型的比较研究

白梦天，李韵，胡竹林*

(1. 昆明医科大学第四附属医院眼科，昆明 650032； 2. 云南省眼科研究所，昆明 650032； 3. 云南省第二人民医院眼科，昆明 650032； 4. 姚克专家工作站，昆明 650032； 5. 昆明医科大学第一附属医院，昆明 650032)

过敏性结膜炎(Allergic conjunctivitis，AC)的常见临床症状为眼红、流泪、眼痒及结膜水肿等。 目前认为，AC 的发生与肥大细胞的激活以及T 细胞的成熟与分化有关。 当机体致敏后，肥大细胞被激活，抗原与眼表肥大细胞膜FcεRI 上的IgE 结合，引起早期相反应(Early phase reaction，EPR)，肥大细胞脱颗粒，释放组胺。 而晚期相反应(Later phase reaction，LPR)则可见大量细胞因子及趋化因子(CCL11、CCL5、CCL24)释放，后者可招募嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞及中性粒细胞等，从而引起角结膜组织的炎性损伤[1]。 此外，结膜上皮和角膜缘处的抗原呈递细胞(Antigen presenting cell，APCs)和树突状细胞(Dendritic Cells，DCs)还可与幼稚CD4+T 细胞、Th0 辅助细胞(Th0 cell)相互作用，从而促进其成熟并转化为Th1 辅助细胞(Th1 cell)、Th2 辅助细胞(Th2 cell)。 Th2 辅助细胞可通过释放 白 介 素- 3 (Interleukin-3，IL-3)、 白 介 素- 4(Interleukin-4，IL-4)、白介素-5(Interleukin-5，IL-5)、白介素-13(Interleukin-13，IL-13)参与过敏反应，并诱导B 细胞产生IgE，促进肥大细胞生长、嗜酸性粒细胞聚集以及粘液的分泌[2]。 此外，CCR-7/CCL21 信号轴被认为参与了成熟DCs 向眼表淋巴结转运的过程。 而成熟的DCs 可主动上调趋化因子受体-7(Chemokine receptoR-7，CCR-7)的反应性，促进局部淋巴内皮细胞对CCL21 的敏感性[3]。

白介素-17(Interleukin-17，IL-17)在2000 年首次由Infante-Duarte[4]报道，并认为IL-17 的产生不同于Th1 辅助细胞、Th2 辅助细胞，其具有独特地分化和调节机制。 IL-17 高表达与自身免疫疾病关系密切，如系统性红斑狼疮、银屑病、类风湿性关节炎、过敏性哮喘等[5]。 Validad 等[6]比较了春季角结膜炎(vernal keratoconjunctivitis，VKC)患者与正常患者血清及泪液中IL-17 含量，发现VKC 患者血清和泪液中IL-17 含量显著提升，并且症状与体征的严重程度与IL-17 含量呈正相关。 而在IL-17 基因缺陷小鼠中，其过敏性鼻结膜炎症状较正常小鼠显著减轻[7]。 因此，有研究者认为，IL-17 表达水平可作为评价过敏性疾病治疗是否有效的指标[8]。

肥大细胞脱颗粒后可释放肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factoR-α，TNF-α)和IL-4。 TNF-α 可刺激结膜成纤维细胞和结膜上皮细胞中CCL5 的释放。 CCL5 不仅可主动招募淋巴细胞核中性粒细胞，还可作为多种炎性细胞的非特异性趋化因子[9]。 此外，有报道证明结膜上皮细胞IL-33/CCL5信号轴与AC 呈正相关[10]。

当前，关于不同抗原在相同条件下致敏性的比较报道甚少。 此外，不同激发途径引发过敏性结膜炎免疫应答是否存在差异，目前尚不清楚。 不同年龄段患者发生过敏性结膜炎时机体免疫应答是否存在差异，还需进一步研究。 因此，为对上述问题进行初步探索，我们分别在不同抗原、不同激发途径、不同小鼠周龄条件下，构建过敏性结膜炎小鼠动物模型，并比较免疫应答状态，筛选最佳致敏条件，以期为过敏性结膜炎小鼠动物模型的建立提供新的思路和方法。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物

SPF 级Balb/c 小鼠65 只，雌性31 只，雄性34只半。 其中，1 周龄小鼠5 只(4.61 ± 0.67)g，2 周龄小鼠5 只(7.14 ± 0.76)g，3 周龄小鼠5 只(9.72± 0.82)g，8 周龄小鼠50 只(21.87 ± 1.72)g。 均由昆明医科大学实验动物中心提供【SCXK(滇)K2015-0002】，操作地点为中国医学科学院昆明动物研究所【SYXK(滇)K2017 - 0008】。 实验方案通过昆明医科大学动物伦理委员会审核(动物伦理审查号：kmmu2019002)。 本实验遵从实验动物3R 原则，并给予实验动物人道主义关怀。

1.1.2 主要仪器与试剂

4/-20℃冰箱，美的公司(合肥)；-80℃超低温冰箱，Thermo 公司(美国)；低温高速离心机，Thermo公司(美 国)； 电 泳仪，六 一 仪 器厂(北 京)；QuantStudio 12 K flex 实时荧光定量PCR 系统，ABI公司(美国)；紫外分光光度计(NanoRrop2000)，Thermo 公司(美国)；凝胶成像仪图像分析系统，Bio-Rad 公司(美国)；组织研磨器，天根生化科技有限公司(北京)；流式细胞仪，BD 公司(美国)；豚草花粉(Ragweed，Short，RW)，Greer Labs 公司(美国)；卵清蛋白(Ovalbumin，OVA)，Sigma 公司(美国)；屋尘螨(House dust mite，HDM)，Greer Labs 公司(美国)；氢氧化铝佐剂(Aluminum hydroxide adjuvant)，Thermo 公 司( 美 国)； RNAiso Plus，TaKaRa 公司(日本)；异丙醇，生工生物工程有限公司(上海)；氯仿，东样化工有限公司(常州)；PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser，TaKaRa 公司(日本)；TB GreenTMPremix Ex TaqTMII，TaKaRa 公司(日本)；白细胞分化抗原CD4-FITC荧光检测试剂，Biolegend 公司(美国)；白介素17-PE 荧光检测试剂，Biolegend 公司(美国)；白细胞分化抗原CD3-PerCP-CY5.5 荧光检测试剂，Biolegend公司(美国)；白细胞分化抗原CD8a-APC-CY7 荧光检测试剂，Biolegend 公司(美国)；白细胞分化抗原CD25-APC 荧光检测试剂，Biolegend 公司(美国)；细胞激活剂，Biolegend 公司(美国)； 破膜液，Biolegend 公司(美国)；红细胞裂解液，Biolegend 公司(美国)；胎牛血清，Roche 公司(瑞士)。

1.2 方法

1.2.1 动物分组及模型的建立

本实验主要分为三个步骤：步骤一为筛选最佳抗原、步骤二为筛选最佳激发方式、步骤三为筛选最佳小鼠周龄。

步骤一(筛选最佳抗原)：随机选择8 周龄Balb/c 小鼠20 只。 随机分为阴性对照组、卵清蛋白组(Ovalbumin，OVA)、屋尘螨组(House dust mites，HDM)、豚草花粉组(Ragweed pollen，RW)(n=5 只/组)。 第1 天，各组分别腹腔注射生理盐水、OVA、HDM、RW 25 mg/kg，均溶解于氢氧化铝佐剂10 μL中。 第7、8 天连续两天各组给予相应抗原10 mg/kg，溶解于氢氧化铝佐剂10 μL 中滴双眼，24 h 后处死。 分离双眼结膜组织后行总RNA 提取、反转录后，RT-qPCR 检测CCL5 mRNA、IL-17 mRNA 表达水平。 分离脾组织，流式细胞术检测IL-17 占CD4+T细胞百分比。

步骤二(筛选最佳激发途径)：随机选择8 周龄Balb/c 小鼠25 只。 随机分为阴性对照组、皮下注射组、雾化吸入组、灌胃组、阳性对照组(滴眼组)(n=5 只/组)。 第1 天各组腹腔注射最佳抗原(根据步骤一结果选择)25 mg/kg，均溶解于氢氧化铝佐剂10 μL 中。 第7、8 天连续两天各组采取相应方式激发，剂量为10 mg/kg，溶解于氢氧化铝佐剂10 μL中。 阴性对照组腹腔注射等质量分数的生理盐水。24 h 后处死。 分离双眼结膜组织后行总RNA 提取、反转录后，RT-qPCR 检测CCL5 mRNA、IL-17 mRNA表达水平。 分离脾组织，流式细胞术检测IL-17 占CD4+T 细胞百分比。

步骤三(筛选最佳小鼠周龄)：随机选择Balb/c小鼠20 只。 随机分为1 周龄组、2 周龄组、3 周龄组、8 周龄组(n=5 只/组)。 第1 天各组腹腔注射最佳抗原(根据步骤一结果选择)25 mg/kg，均溶解于氢氧化铝佐剂10 μL 中。 第7、8 天，进行抗原激发(根据步骤二结果选择)，剂量为10 mg/kg，溶解于氢氧化铝佐剂10 μL 中。 24 h 后处死。 分离双眼结膜组织后行总RNA 提取、反转录后，RT-qPCR 检测CCL5 mRNA、IL-17 mRNA 表达水平。 分离脾脏组织，流式细胞术检测IL-17 占CD4+T 细胞百分比。

1.2.2 小鼠结膜组织CCL5 mRNA、IL-17 mRNA 相对表达情况

TRIzol 法进行总RNA 提取，逆转录为cDNA，模板3 μL，总体系为20 μL。 CCL5 正向引物：5′-TGCCTAAAGTGTCACATTTTGCTCA-3′，反 向 引 物：5′-CTAAGGAGTGATACACCTCGTAGTTG-3′。 IL-17正 向 引 物：5′-TTTAACTCCCTTGGCGCAAAA-3′，反向引物：5′-CTTTCCCTCCGCATTGACAC-3′。 β-actin正向引物：5′-GGCTGTATTCCCCTCCATCG-3′，反向引物：5′-CCAGTTGGTAACAATGCCATGT-3′。

1.2.3 脾单细胞悬液的制备

彻底麻醉小鼠后，沿左侧腹部剪开腹部，暴露脾。 小心分离其周围脏器其脂肪组织后，剪下脾，PBS 反复漂洗后放置于10 mL 培养皿中。 取5 mL无菌注射器柱塞，以末端扁平部顺时针轻柔研磨脾，吹打混匀。 将脾细胞转移至200 目筛网上再次研磨，筛网下方收集悬液。 1000 rpm 10 min 离心。弃上清，加入红细胞裂解液5 mL，室温，3 min，加入PBS 10 mL，1000 rpm 10 min 离心。 PBS 漂洗2 次，加入5 mL PBS 重悬备用。

1.2.4 流式细胞术

取脾单细胞悬液3 mL 滴加于细胞培养板中，RPMI 1640 培养基3.6 mL，胎牛血清0.4 mL，细胞激活剂10 μL，吹打混匀后放置于细胞培养箱中孵育。 24 h 后，1200 rpm，8 min 离心，弃上清。 加入0.5 mL PBS 重悬细胞，加入CD3-PerCP-CY5.5 5 μL，CD4-FITC 5 μL，CD8a-APC-CY7 5 μL，室温避光，30 min。 加入破膜工作液1 mL，室温避光，30 min。 1200 rpm，8 min 离心，弃上清。 加入IL-17-PE 2 μL，室温避光，30 min。 加入1 mL PBS 吹打混匀，1200 rpm，8 min 离心，弃上清。 加入PBS 200 μL，上机。

1.3 统计学分析

实验数据采用SPSS 20.00 及Graph Pad Prism 7.0 整理分析，所有数据均符合正态分布。 计量资料以平均值±标准差(±s)表示。 多组样本均数之间的比较采用单因素方差分析(One-way ANOVA)，组间两两比较采用LSD 法，均以P＜0.05表示差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 不同抗原构建小鼠过敏性结膜炎模型后脾单细胞悬液中IL-17 占CD4+ T 百分比情况及结膜组织CCL5 mRNA、IL-17 mRNA 相对表达水平

IL-17 在阴性对照组、OVA 组、HDM 组、RW 组小鼠脾细胞悬液中占CD4+T 细胞百分比为(0.54 ±0.05)%、(3.17 ± 0.10)%、(2.96 ± 0.14)%、(3.95± 0.14)%。 (F=778.9，P＜0.05)。 阴性对照组与OVAW 组(P= 0.000)，OVA 组 与HDM 组(P=0.010)、R 组、HDM 组、RW 组(P＜0.05)差异具有显著性(图1A)。

CCL5 mRNA 在阴性对照组、OVA 组、HDM 组、RW 组的相对表达量分别为(1.00 ± 0.00)、(2.58± 0.55)、(2.36 ± 0.41)、(3.74 ± 0.55) (F=19.268，P＜0.05)。 阴性对照组与OVA 组(P=0.014)、HDM 组(P=0.031)、RW 组(P=0.000)，RW 组与HDM 组(P=0.031)之间差异有显著性(图1B)。 IL-17 mRNA 在阴性对照组、 OVA 组、HDM 组、RW 组的相对表达量分别为(1.00 ±0.00)、(2.07 ± 0.51)、(3.46 ± 0.57)、(4.34 ±0.65)(F=29.452，P=0.000)。 阴性对照组与OVA组(P=0.031)、HDM 组(P=0.000)、RW 组(P=0.003)之间差异具有显著性(图1C)。

本实验结果提示，在相同条件下，豚草花粉具有更佳的致敏性，因此在后续实验中，我们将以豚草花粉作为主要抗原。

2.2 不同激发途径构建小鼠过敏性结膜炎模型后脾IL-17 占CD4+T 百分比情况及结膜组织CCL5 mRNA、IL-17 mRNA 相对表达水平

IL-17 在阴性对照组、皮下注射组、雾化吸入组、灌胃组、阳性对照组小鼠脾细胞悬液中占CD4+T 细胞百分比为(0.55 ± 0.05)%、(3.14 ± 0.11)%、(2.93 ± 0.14)%、 (2.74 ± 0.14)%、 (4.21 ±0.21)%(F=449.2，P＜0.05)。 阴性对照组与皮下注射组、雾化吸入组、灌胃组、阳性对照组(P＜0.05)差异有显著性。 皮下注射组与灌胃组、阳性对照组(P＜0.05)差异具有显著性(图2A)。

CCL5 mRNA 在阴性对照组、皮下注射组、灌胃组、雾化吸入组、阳性对照组的相对表达量分别为(1.00 ± 0.00)、(2.64 ± 1.79)、(1.23 ± 0.35)、(1.39 ± 0.57)、(2.96 ± 0.54)(F= 298.93，P=0.000)。 阴性对照组与皮下注射组(P=0.000)、雾化吸入组(P=0.000)、阳性对照组(P=0.000)，皮下注射组与灌胃组(P=0.000)、阳性对照组(P=0.0131)之间差异有显著性(图2B)。 IL-17 mRNA在阴性对照组、皮下注射组、灌胃组、雾化吸入组、阳性对照组的相对表达量分别为(1.00 ± 0.00)、(3.20 ± 0.24)、(2.94 ± 0.29)、(2.80 ± 0.10)、(3.26 ± 0.20)(F=63.883，P=0.000)。 阴性对照组与皮下注射组(P=0.000)、灌胃组(P=0.000)、雾化吸入组(P=0.000)、阳性对照组(P=0.000)，皮下注射组与灌胃组(P=0.0085)之间差异具有显著性(图2C)。

本实验结果提示，在相同条件下，通过皮下注射进行激发后，结膜组织CCL5 mRNA、IL-17 mRNA相对表达水平及脾细胞IL-17 占CD4+T 百分比更接近阳性对照组，因此在后续实验中，我们将采用皮下注射法进行激发。

2.3 不同周龄小鼠构建过敏性结膜炎模型后脾脏IL-17 占CD4+ T 百分比情况及结膜组织CCL5 mRNA、IL-17 mRNA 相对表达水平

IL-17 在1 周龄组、2 周龄组、3 周龄组、8 周龄组小鼠脾细胞悬液中占CD4+T 百分比为(2.75 ±0.08)%、(2.72 ± 0.16)%、(3.06 ± 0.34)%、(3.29± 0.14)%。 (F=8.614，P＜0.05)。 8 周龄与1 周龄、2 周龄(P＜0.05)差异具有显著性(图3A)。

CCL5 mRNA 在1 周龄组、2 周龄组、3 周龄组以及8 周龄组的相对表达量分别为(1.74 ± 0.13)、(1.78 ± 0.14)、(2.55 ± 0.03)、(2.59 ± 0.04)(F=55.13，P= 0.000)。 1 周龄组与3 周龄组(P=0.0001)、8 周龄组(P=0.000)，2 周龄组与3 周龄组(P=0.0001)、8 周龄组(P=0.0001)差异有显著性(图3B)。 IL-17 mRNA 在1 周龄组、2 周龄组、3周龄组以及8 周龄组的相对表达量分别为(1.98 ±0.17)、(1.97 ± 0.17)、(2.95 ± 0.07)、(2.93 ±0.12)(F=45.54，P=0.000)。 1 周龄组与3 周龄组(P=0.0002)、8 周龄组(P=0.0002)，2 周龄组与3 周龄组(P=0.0002)、8 周龄组(P=0.0002)差异具有显著性(图3C)。

3 讨论

图1 不同抗原构建小鼠过敏性结膜炎模型后脾单细胞悬液中IL-17 占CD4+ T 百分比(A)以及结膜组织CCL5 mRNA (B)、IL-17 mRNA (C)相对表达水平Note.*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001，****P＜0.0001，the same in the following Figures.Figure 1 Percentage of IL-17 in CD4+ T in spleen single cell suspension (A) and relative expression levels of CCL5 mRNA (B) and IL-17 mRNA (C) in conjunctival tissues and after constructing mouse model of allergic conjunctivitis with different antigens

蛋白类、花粉类、尘螨类物质不仅为过敏性结膜炎患者常见的致敏原，也为构建过敏性结膜炎动物模型的常用抗原。 其可建立稳定可靠的过敏性结膜炎动物模型[11-13]。

图2 不同激发途径构建小鼠过敏性结膜炎模型后脾单细胞悬液中IL-17 占CD4+ T 百分比(A)及结膜组织CCL5 mRNA(B)、IL-17 mRNA(C)相对表达水平Figure 2 Percentage of IL-17 in CD4+ T in spleen single cell suspension and relative expression levels of CCL5 mRNA (B) and IL-17 mRNA (C) in conjunctival tissues and after constructing mouse model of allergic conjunctivitis with different methods of challenge

图3 不同周龄构建小鼠过敏性结膜炎模型后脾单细胞悬液中IL-17 占CD4+ T 百分比情况(A)及结膜组织CCL5 mRNA(B)、IL-17 mRNA(C)相对表达水平Figure 3 Percentage of IL-17 in CD4+ T in spleen single cell suspension (A) and relative expression levels of CCL5 mRNA (B) and IL-17 mRNA (C) in conjunctival tissues and after constructing mouse model of allergic conjunctivitis with different age

目前，关于上述三类抗原在相同条件下构建过敏性结膜炎致敏效力的比较研究报道较少。 因此，我们首先对OVA、HDM、RW 进行致敏性的比较。我们的实验结果发现，豚草花粉激发小鼠后，小鼠结膜组织中CCL5 mRNA、IL-17 mRNA 表达最高、脾脏单细胞悬液中IL-17 百分比最高，提示豚草花粉在此实验条件下致敏效力最佳。 豚草花粉包含至少52 种抗原成分，其中22 种可特异性结合IgE。 此外，研究者将豚草花粉进行分离和提纯后得到大量可致敏的蛋白质，分子大小多在5 × 103～ 63 ×103[14-16]，以30 × 103～40 × 103抗原性最强。 豚草花粉过敏患者出现眼部症状占其过敏患者的89.4%，合 并 哮 喘 者 占 21.21%[17]。 此 外，Furmonaviciene 等[18]发现，序列同一性超过25%的不同类型的过敏原之间具有相似的IgE、T 细胞识别表位从而更易发生交叉反应。 陶爱林等[19]通过聚类分析发现在NCBI 数据库中可找到许多与豚草花粉高度同源的不同类型的过敏原，提示豚草花粉可与多种不同类型的过敏原发生交叉反应，从而极易引发过敏性疾病。

随后，使用豚草花粉对Balb/c 小鼠予以灌胃、雾化吸入、皮下注射的激发方式观察免疫应答状态。 实验结果发现，皮下注射组与阳性对照组(滴眼激发)小鼠结膜组织CCL5 mRNA 和IL-17 mRNA表达情况及脾脏单细胞悬液中IL-17 百分比最为接近，提示皮下注射激发更能有效诱导小鼠过敏性结膜炎的发生。 有研究指出，皮下细胞外基质(extracellular matrix，ECM)可缓慢地吸收药物，尽管其最大血药浓度(maximum blood concentration，Cmax)低于静脉注射，但可明显延长注射药物的Cmax持续时间[20]。 此外，经皮下注射分子量＞20 × 103的药物可直接经间质淋巴管收集，豚草花粉的主要抗原成分可直接进入淋巴系统[21]。 Carton 等[22]使用荧光标记的MHC 复合物结合CD40 示踪法发现，皮肤中DCs 可迅速移行至注射部位皮下。 因此有研究者认为，皮下注射更易引起免疫反应[23]。 灌胃能很好地激发消化系统过敏性症状，从而引起一系列食物性过敏性症状，但豚草花粉进入胃内后在胃蛋白酶的作用下，其分子结构发生改变，致使全身致敏效应下降[24]。 Balb/c 小鼠较易产生针对花粉的气道高反应性，但致敏原的多次雾化激发较易使其产生耐受，一定程度上降低过敏反应和气道高反应表现[25]。

吴旭颖等[26]分别选取5 周龄和10 周龄正常Balb/cA-nu 小鼠，抽取外周血行流式细胞术，发现5周龄小鼠外周血中CD19+B 细胞、B220+B 细胞、NK细胞、粒细胞比例均低于10 周龄小鼠。 这与我们的实验结果存在一定差异，可能的原因为：(1)小鼠品系差异，Balb/cA-nu 小鼠为无胸腺，T 细胞缺陷的Balb/c 裸鼠[27]。 (2) 处理方式差异，本研究中Balb/c 小鼠均为经抗原处理后的小鼠。 (3)处理时间节点不同，我们选择分别选了哺乳期、断奶期、生长期、性成熟期小鼠。 而目前未见可较好解释不同周龄Balb/c 小鼠免疫应答差异的相关报道，因此具体机制尚不清楚。

因此，根据本实验结果，我们认为，豚草花粉在构建过敏性结膜炎小鼠动物模型中具有更好的致敏性。 皮下注射法激发抗原在过敏性结膜炎小鼠动物模型构造中可取得较满意效果。 皮下注射法激活抗原未见明显的小鼠的眼部症状及体征，但全身和局部均呈免疫应答状态。 3 周龄Balb/c 小鼠免疫应答反应已较为接近成年Balb/c 小鼠。