HPLC-ELSD 法同时测定银怡片中2 种成分

于桂芳 胡宝玲 胡军华 曹苗苗 黄文哲 王振中 萧 伟

（江苏康缘药业股份有限公司， 江苏 连云港222001）

氨基葡萄糖是一种从天然甲壳中提取的氨基己糖，为人体及动物体内关节组织中糖蛋白的天然成分［1］；硫酸软骨素是一种从动物软骨中提取的酸性粘多糖［2］，两者广泛用于增加骨密度类的保健食品中。目前，国内外法规及文献报道的氨基葡萄糖常用检测方法有紫外分光光度 法［3-4］、HPLC-UV 法［5-8］、HPLC-ELSD 法［9-11］，其中紫外分光光度法样品需衍生化处理，操作繁琐，稳定性、重复性差；HPLC-UV 法（包括衍生化法） 灵敏度低，衍生操作繁琐；HPLC-ELSD 灵敏度高，但色谱柱大多采用C18，出峰时间短，分离效果差，少数采用氨基色谱柱，但重复性差，而硫酸软骨素常用的检测方法有Elson-Morgan 法［12］、咔唑法［13］、滴定法［14-15］、HPLC-酶解法［16］、HPLC-UV［17-18］法、HPLC-ELSD 法［19］，其中前三者操作繁琐，专属性、准确性差；HPLC-酶解法专属性、准确性好，但样品处理繁琐，而且酶试剂价格较高；HPLC-ELSD 偶有报道，但与氨糖一样，配套的色谱柱大多为C18和氨基；目前，以氨基葡萄糖和硫酸软骨素为原料的保健食品中同时测定两者含有量时主要依据GB／T 20365-2006［20］，该方法采用紫外检测器、强阴离子C18色谱柱、离子对试剂，存在灵敏度低、分离效果差、操作繁琐等不足，故开发一种操作简便、灵敏度和准确度高、重复性好的方法具有重要意义。本实验针对氨基葡萄糖、硫酸软骨素紫外吸收弱和极性大的问题，采用高效液相-蒸发光散射检测器（HPLC-ELSD）法结合酰胺色谱柱同时测定银怡片中两者含有量，以期为该制剂质量控制提供参考。

1 材料

1.1 试剂与药物D-葡萄糖盐酸盐（含有量100%，批号140649-201304）、硫酸软骨素钠（含有量99.1%，批号140792-201702） 对照品均购自中国食品药品检定研究院。D-氨基葡萄糖硫酸钾盐（批号0220170355）、硫酸软骨素（来源牛骨，批号072017020） 原料药（江苏奥新生物工程有限公司）。银怡片为江苏康缘药业股份有限公司在研品种，是由骨碎补、葛根、D-氨基葡萄糖硫酸钾盐、硫酸软骨素钠、柠檬酸钙、辅料经加工制成的保健食品，批号20180201、20180202、20180203。乙腈（批号17050287）、三乙胺（批号16050721） 为色谱纯（美国Tedia 公司）；乙酸铵为色谱纯［批号1704005，阿拉丁试剂（上海） 有限公司］；超纯水（18 Ω）。

1.2 仪器 Agilent 1260 高效液相色谱仪（美国Agilent 公司），配置Alltech 2000ES ELSD 检测器；XP6 电子天平（瑞士Mettler-Toledo 公司）；BSA224S-CW 电子天平（德国Sartorius 公司）；Milli-Q Academic 超纯水机（美国Millipore公司）；KQ-500DB 数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；CIMODHG-91438S-Ⅲ电热恒温鼓风干燥箱（上海新苗医疗器械制造有限公司）。

2 方法与结果

2.1 色谱条件 Waters Xbridge Amide 色谱柱（酰胺柱，4.6 mm×150 mm，3.5 μm）；以乙腈-50 mmol／L 乙酸铵（含0.6%三乙胺） 为流动相，等度洗脱（75：25）；体积流量0.8 mL／min；柱温40℃；蒸发光散射检测器，漂移管温度105℃；载气N2，体积流量2.5 mL／min；进样量5 μL。

2.2 对照品溶液制备 分别精密称取经105℃干燥4 h 的氨基葡萄糖盐酸盐、硫酸软骨素钠对照品4.631、4.705 mg，置于20 mL 量瓶中，加入2 mL 乙腈振荡使其分散均匀，加水超声溶解后冷却至室温，水定容至刻度，摇匀，即得每1 mL 分别含氨基葡萄糖盐酸盐、硫酸软骨素钠0.231 6、0.2 331 mg 的低浓度对照品溶液，同法制备每1 mL分别含两者0.587 7、0.589 3 mg 的高浓度对照品溶液。

2.3 供试品溶液制备 取本品适量，除去薄膜衣研细，精密称取100 mg，置于50 mL 量瓶中，加入5 mL 乙腈超声1 min，加水至接近刻度，超声10 min，水定容至刻度，摇匀，离心，即得。

2.4 专属性试验 取不含氨基葡萄糖硫酸钾盐、硫酸软骨素钠的阴性样品，按“2.3” 项下方法制备阴性供试品溶液。精密吸取对照品、供试品、阴性供试品溶液各5 μL，在“2.1” 项色谱条件下进样测定，结果见图1。由图可知，供试品呈现与对照品保留时间一致的色谱峰，阴性供试品在相应保留时间处基本无杂质峰出现，表明该方法专属性良好。

图1 各成分HPLC-ELSD 色谱图

2.5 线性关系考察 分别精密称取105℃下干燥4 h 的氨基葡萄糖盐酸盐、硫酸软骨素钠对照品 43.118、42.550 mg，置于10 mL 量瓶中，加入1 mL 乙腈振荡使其分散均匀，加水超声溶解后冷却至室温，水定容至刻度，摇匀，即得每1 mL 分别含氨基葡萄糖盐酸盐、硫酸软骨素钠4.311 8、4.216 7 mg 的贮备液，精密量取0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6 mL 于10 mL 量瓶中，水稀释至刻度，制成每1 mL 含氨基葡萄糖盐酸盐0.172 5、0.258 7、0.344 9、0.431 2、0.517 4、0.603 7、0.689 9 mg，含硫酸软骨素钠0.168 7、0.253 0、0.337 3、0.421 7、0.506 0、0.590 3、0.674 7 mg 的系列质量浓度的对照品溶液，在“2.1” 项色谱条件下进样测定。以质量浓度的自然对数为横坐标（X），峰面积的自然对数为纵坐标（Y） 进行回归，得方程分别为氨基葡萄糖盐酸盐Y＝1.362 5X＋6.12（r＝0.999 9）、硫酸软骨素 钠Y＝1.398 6X＋5.075 8（r＝0.999 4），分别在 0.172 5～0.689 9、0.168 7～0.674 7 mg／mL范围内线性关系良好。

2.6 定量限检测 取低质量浓度对照品溶液逐级稀释，以S／N＝10 为定量限，测得氨基葡萄糖盐酸盐、硫酸软骨素钠分别为0.162、0.283 μg。

2.7 精密度试验 取低、中、高质量浓度对照品溶液，在“2.1” 项色谱条件下进样测定6 次，测得氨基葡萄糖盐酸盐峰面积RSD 分别为0.73%、0.66%、1.38%，硫酸软骨素钠分别为2.47%、2.09%、1.57%，表明仪器精密度良好。

2.8 稳定性试验 取同一对照品、供试品溶液，于0、2、4、6、8、10、12、15 h 在“2.1” 项色谱条件下进样测定，测得氨基葡萄糖盐酸盐峰面积RSD 分别为0.96%、1.97%，硫酸软骨素钠分别为1.65%、3.15%，表明溶液在15 h 内稳定性良好。

2.9 重复性试验 取同一批样品（批号20180201），按“2.3” 项下方法平行制备6 份供试品溶液，在“2.1” 项色谱条件下进样测定，测得氨基葡萄糖硫酸钾盐、硫酸软骨素钠含有量RSD 分别为1.95%、0.32%，表明该方法重复性良好。

2.10 加样回收率试验 精密称取本品50 mg（批号20180201，氨基葡萄糖硫酸钾盐、硫酸软骨素钠含有量分别为27.02%、23.16%），置于50 mL 量瓶中，对照品加入量与所取供试品中待测成分量之比为1∶1（以固体形式加入），按“2.3” 平行制备6 份供试品溶液，在“2.1” 项色谱条件下测定，结果见表1。

2.11 样品含有量测定 取本品3 批，按“2.3” 项下方法制备供试品溶液，在“2.1” 项色谱条件下进样测定，结果见表2。此外，由处方可测得氨基葡萄糖硫酸钾、硫酸软骨素钠理论含有量分别为28%、23%，可知实测值与理论值较为接近。

3 讨论

3.1 色谱柱选择 亲水性色谱柱（HILIC） 适合分离在反相色谱柱上不保留的极性化合物，尤其是对强极性碱性化合物的保留能力较强，通常用于分离水溶性极强的极性化合物，而且适配于LC-MS 及LC-ELSD。酰胺色谱柱属于HILIC 系列，本实验以其分离水溶性成分氨基葡萄糖和硫酸软骨素，保留时间由C18色谱柱的2 min 左右延长至7 min（氨基葡萄糖） 和15 min（硫酸软骨素） 左右，同时保留时间适中，分离效果较好。另外，氨基色谱柱虽也可用于糖类等大极性化合物的分离，但其重复性差，故综合考虑，本实验选择HILIC 系列的Amide 色谱柱。

表1 各成分加样回收率试验结果（n＝6）

表2 各成分含有量测定结果（n＝3）

3.2 检测器选择 ELSD 作为通用型检测器，不依赖于化合物光学特性，对非挥发化学组分均有良好的响应，广泛应用于皂苷、萜类、生物碱、糖等中药成分的质量控制［21］。另外，氨基葡萄糖、硫酸软骨素几乎无紫外吸收，可不经衍生化直接测定，操作简便，灵敏度高，故选择ELSD 检测器。

3.3 流动相选择 本实验比较了乙腈-水、乙腈-甲酸，乙腈-三乙胺、乙腈-乙酸铵、乙腈-乙酸铵-三乙胺等流动相，发现乙腈-水洗脱时氨基葡萄糖、硫酸软骨素均未出峰；乙腈-甲酸洗脱时氨基葡萄糖裂峰，峰形差，而硫酸软骨素未出峰；乙腈-三乙胺洗脱时两者均未出峰；乙腈-乙酸铵洗脱时两者均出峰，但氨基葡萄糖裂峰，而且与硫酸软骨素几乎重合；乙腈-乙酸铵-三乙胺洗脱时，两者保留时间合适，峰形相对较好，故选择该流动相。然后，在此基础上考察乙酸铵、三乙胺的浓度，优选出分离效果最佳的乙腈-50 mmol／L 乙酸铵（含0.6%三乙胺）。

3.4 与GB 20365-2006 方法对比 前期取同一批样品（批号20180201），按照GB 20365-2006 方法测定，发现氨基葡萄糖、硫酸软骨素几乎无保留，均在2 min 左右出峰，与杂质峰的分离度小于1.0，无法准确测定两者含有量。本实验发现2 种成分分别在6、14 min 左右出峰，保留时间适中，分离度大于1.5，而且所测含有量与相应理论值接近。

4 结论

本实验采用HPLC-ELSD 法，参考GB／T 20365-2006 中供试品处理方法同时测定银怡片中氨基葡萄糖、硫酸软骨素的含有量，经方法学验证发现，该成分专属性、精密度、准确性、重复性等较好，而且操作简便，灵敏度高，适合增加骨密度类保健食品中2 种成分含有量的同时测定，并为该类产品质量控制提供参考依据。