甘肃各主产区当归UPLC多成分含量测定及评析

徐小琼，陈 博，张小波，陈 娟，晋 玲,5*

1甘肃中医药大学，兰州 730000；2甘肃医学院，平凉 744000；3中国中医科学院中药资源中心 道地药材国家重点实验室培育基地，北京 100700；4兰州大学药学院；5甘肃中医药大学中(藏)药资源研究所，兰州 73000

当归为伞形科植物当归Angelicasinensis(Oliv.)Diels的干燥根，秋季采挖，除去须根和泥沙，捆成小把，晾干。当归味甘、辛，性温，归心、肝、脾经，具有活血、调经、止痛的功效[1,2]。甘肃自古为当归道地产区，年产量占全国当归总产量的80%以上，甘肃省作为全国当归药材生产大省，80年代初至今，种植面积大幅增加，盲目引种栽培，导致当归产量供过于求，但药材质量参差不齐[3-7]。本课题组在甘肃省各县区实地调查采样，采样点达22个，样品均为栽培品，采用UPLC建立了当归指标含量测定方法，结合主成分分析方法进行分类分析，并测定其中8个指标成分含量，以期为甘肃省当归质量控制提供依据。

1 仪器与材料

Waters Acquity UPLC超高效液相色谱仪(美国Waters公司)；CP114型电子分析天平(奥豪斯仪器(上海)有限公司)；101型电热鼓风干燥箱(北京市永光明医疗器械厂)；Option R7 utra AN超纯水系统(英国Elga Lab Waters公司)；KQ 5200DV型数控超声波清洗仪(昆山市超声仪器有限公司)；0.22 μm微孔滤膜(上海安谱实验科技股份有限公司)。

绿原酸(批号：L-007-181112)、阿魏酸(批号：A-002-181216)、洋川芎内酯I(批号：Y-085-181011)、洋川芎内酯H(批号：Y-084-190527)、洋川芎内酯A(批号：Y-083-181011)、阿魏酸松柏酯(批号：A-001-181103)、藁本内酯(批号：G-010-181230)、丁烯基苯酞(批号：D-057-190506)对照品(成都瑞芬思生物科技有限公司，纯度均在98%以上)。甲醇色谱纯，水为超纯水，其他试剂均为分析纯。22批当归样品均为本课题组自采，经甘肃中医药大学晋玲教授鉴定均为药典正品。样品阴干，打粉过3号筛(50目)备用，具体采样信息见表1。

表1 当归药材样品信息

2 方法与结果

2.1 色谱条件

Waters ACQUITY UPLC®BEH C18色谱柱(2.1 mm×50 mm，1.7 μm)；流动相为甲醇(A)-1%乙酸水(B)，梯度洗脱(0～5 min，5%→30% A；5～6.5 min，30%→35% A；6.5～8.5 min，35%→50%A；8.5～14 min，50%→80%A；14～17 min，80% A；17～22 min，80%→100%A；22～27 min，100%→5%A)；流速0.3 mL/min；检测波长270 nm；柱温30 ℃；样品温度20 ℃，进样量3 μL。

2.2 溶液制备

2.2.1 混合对照品溶液制备

分别取绿原酸、阿魏酸、洋川芎内酯I、洋川芎内酯H、洋川芎内酯A、阿魏酸松柏酯、藁本内酯、丁烯基苯酞对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1 mL分别含绿原酸0.061 0 mg、阿魏酸0.050 0 mg、洋川芎内酯I 0.040 0 mg、洋川芎内酯H 0.024 0 mg、洋川芎内酯A 0.063 6 mg、阿魏酸松柏酯0.224 mg、藁本内酯2.00 mg、丁烯基苯酞0.032 8 mg的各对照品储备液。再精密吸取各对照品储备液各1 mL，置10 mL棕色容量瓶中，以甲醇定容至刻度，作为混合对照品溶液，混标色谱图见图1A。

2.2.2 供试品溶液制备

取样品粉末约5.0 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，加入50%甲醇50 mL，称定重量，超声提取(60 kHz，250 W)45 min，放冷，称重并用50%甲醇补足减失的重量，过滤，取续滤液，过0.22 μm微孔滤膜，即得，样品色谱图见图1B。

2.2.3 线性范围考察

分别精密吸取上述对照品储备液各1 mL，再逐级稀释1、10、20、30、40倍，制成5个系列浓度的对照品溶液。分别精密吸取3 μL注入高效液相色谱仪，测定峰面积，以峰面积(Y)对进样量(X)进行线性回归，结果见表2。

2.3 方法学考察

2.3.1 精密度试验

取1号样品，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，按“2.1”项色谱条件连续进样6次，测得8个共有峰相对峰面积RSD分别为2.67%、1.91%、1.02%、0.96%、2.91%、1.72%，2.02%、1.32%，表明仪器精密度良好。

图1 混合对照品(A)和当归样品(B)UPLC图

2.3.2 重复性试验

取1号样品6份，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，按“2.1”项色谱条件进样测定，测得8个共有峰相对峰面积RSD分别为2.77%、2.58%、2.00%、1.96%、2.91%、2.42%、2.62%、2.02%，表明该方法重复性良好。

2.3.3 稳定性试验

取1号样品，按“2.2 2”项下方法制备供试品溶液，于0、2、4、12、48 h按“2.1”项色谱条件进样测定5次，测得8个共有峰相对峰面积RSD分别为2.81%、2.58%、2.31%、2.00%、2.88%、2.52%，2.69%、2.43%，表明供试品溶液在48 h内稳定性良好。

表2 线性关系考察结果

2.3.4 加样回收率试验

取1号样品6份，每份约5.0 g，精密称定，分别精密加入绿原酸、阿魏酸、洋川芎内酯I、洋川芎内酯H、洋川芎内酯A、阿魏酸松柏酯、藁本内酯、丁烯基苯酞各对照品适量，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，供试品溶液均稀释50倍，按“2.1”项色谱条件进样测定。计算加样回收率及RSD%，结果见表3，均符合要求。

表3 加样回收实验结果

续表3(Continued Tab.3)

化合物Compound样品中含量Originalamount(mg)加入量Addedamount(mg)测得量Detectedamount(mg)回收率Recovery(%)平均回收率Averagerecovery(%)RSD(%)洋川芎内酯ISenkyunolideI0.02100.02100.04290.960393.303.000.02100.02100.04400.91430.02100.02100.04430.90260.02100.02100.04380.92240.02100.02100.04380.92240.02100.02100.04260.9736洋川芎内酯HSenkyunolideH0.00430.00410.00841.000094.902.800.00410.00410.00860.92580.00410.00410.00850.95150.00420.00410.00860.93210.00420.00410.00860.93640.00410.00410.00850.9471洋川芎内酯ASenkyunolideA0.00230.00240.00471.008598.602.700.00230.00240.00471.00510.00230.00240.00470.99500.00230.00240.00471.00300.00220.00240.00470.96000.00210.00240.00460.9440阿魏酸松柏酯Coniferylferulate0.02010.02620.04860.919692.702.700.02010.02620.04900.90690.01970.02620.04700.96010.01710.02620.04640.89450.01880.02620.04690.93270.01990.02620.04750.9496藁本内酯Ligustilide0.80480.81391.62900.987598.002.300.78820.81391.63100.96570.79930.81391.64900.95790.80920.81391.60701.02020.80520.81391.63200.98440.80520.81391.64800.9657丁烯基苯酞Butenylphthalide0.01470.01800.03290.989698.002.300.01440.01800.03310.96460.01480.01800.03300.99170.01440.01800.03221.01350.01540.01800.03410.96360.01540.01800.03430.9534

2.4 含量测定

吸取“2.2.1”，“2.2.2”项下混合对照品溶液和22份样品溶液各3 μL，按“2.1”项色谱条件进样测定，用外标法计算含量，结果见表4。

表4 含量测定结果

图2 不同产区样品8种成分含量箱线图

2.5 P值分析[8,9]

2.6 当归指标成分主成分分析(PCA)[10]

用SPSS 19.0软件对22份不同产区当归药材中8个指标成分含量的原始数据进行标准化处理，以主成分的特征值及贡献率为依据，进行主成分分析，计算相关系数矩阵，主成分特征值、累积贡献率，并计算主成分综合得分，对各产区当归药材综合质量进行评价。根据因子分析结果可得主成分特征值见表5，由表5可知，当归主成分分析中前2个主成分的特征值均大于1，第3个主成分特征值接近1，前3个主成分的连线较陡峭，累积方差贡献率为75.358%，以因子的方差累计贡献率达到70%以上作为主成分提取的标准，提取前3个主成分进行分析较为合适，当归主成分矩阵见表6。

根据表5、6，以X1、X2、X3代表3个主成分，作为22份不同产区当归8个指标成分所表达的信息，建立当归质量的评价模型，得出如下线性关系表达式：

X1=0.209H1-0.016H2-0.165H3+0.26H4+0.136H5-0.143H6-0.247H7+0.281H8

X2=-0.109H1+0.458H2+0.401H3+0.244H4-0.073H5-0.25H6+0.078H7+0.094H8

X3=0.425H1+0.334H2-0.191H3+0.119H4-0.598H5+0.525H6+0.159H7+0.176H8

表达式中各变量不是原始变量，而是标准化变量，将上述表达式，与所对应的3个主成分的方差贡献率结合，得到当归质量综合评价函数的表达式X综合得分=(39.418X1+23.828X2+12.112X3)/75.358，根据以上表达式得到不同产区当归综合得分及排序见表7。综合得分越高，表明当归质量越好。甘肃省各产区当归的综合得分为：定西岷县>定西漳县>定西临洮县>定西渭源县>陇南宕昌县>陇南文县>陇南礼县>陇南武都县>天水清水县>天水武山县>临夏康乐县>临夏积石山县>临夏临夏县>武威古浪县>甘南卓尼县>甘南临潭县>甘南舟曲县>甘南迭部县>武威天柱县>张掖肃南县>张掖民乐县>兰州永登县。

表5 主成分特征值

续表6(Continued Tab.6)

化合物Compound主成分1Component1主成分2Component2主成分3Component3洋川芎内酯ASenkyunolideA0.136-0.073-0.598阿魏酸松柏酯Coniferylferulate-0.143-0.250.525藁本内酯Ligustilide-0.2470.0780.159丁烯基苯酞Butenylphthalide0.2810.0940.176

表7 当归主成分得分及综合得分排名

3 讨论

挥发油是当归药材的重要有效成分之一，实验数据表明藁本内酯含量最高，除此之外还有丁烯基酞内酯、洋川芎内酯、亚丁基苯酞以及当归酮等[11-12]，Song等[11]研究发现当归中的挥发油能稳定心肌细胞膜，保护线粒体和溶酸体的正常功能，增强心肌细胞抗缺氧能力，从而减轻缺氧对心肌细胞的损伤程度。Chang等[12]研究发现阿魏酸能抑制胆固醇的合成，降低血脂，还具有一定的抗氧化和自由基清除作用，抑制脂质在血管壁的沉积，从而保护血管内膜不受损伤，阿魏酸、藁本内酯、丁烯基酞酞能增强血浆纤维蛋白的溶解活性，促进血浆纤维蛋白的溶解过程，延长血栓形成时间，发挥明显的抗血栓作用。故本研究选择绿原酸、阿魏酸、洋川芎内酯I、洋川芎内酯H、洋川芎内酯A、阿魏酸松柏酯、藁本内酯、丁烯基苯酞作为当归药材的指标成分进行研究。

当归为2015年版《中国药典》收载品种，药典以HPLC测定的阿魏酸含量作为当归药材的考察指标，专属性不强，指标成分单一。故本研究采用UPLC技术同时测定当归药材中8个指标成分含量，该方法简便、快捷，重复性好，可以更全面评价当归药材质量。在实验过程中通过全波长扫描(200～500 nm)确定指标成分在270 nm处均有最大吸收，在最大吸收波长测定，提高了检测的灵敏度。

主成分分析是一种多指标的综合评价方法，本研究以22份当归的8个指标成分检测结果为基础，采用主成分分析得到了3个主成分因子，主成分分析结果中，定西岷县当归药材的综合得分最高，且定西市、陇南市、天水市各产地当归药材综合得分排名靠前，兰州市当归综合得分最低。因此，定西市当归总体质量优于甘肃省其它产区。

为进一步了解不同产地当归药材中指标成分含量差异的来源，对当归样品多指标成分进行定量分析，并结合1个易于计算和可见的参数P值进行分析，得到绿原酸、洋川芎内酯A、藁本内酯在各个样品中含量存在较大波动，对当归药材的质量有较大影响。