酸枣叶醇提物对小鼠巨噬细胞M1和M2型极化的影响

董建新，刘晓光，李晨曦，祁雪慧，朱毓永，王 悦，单梅华*

1河北民族师范学院 生物与食品科学学院，承德 067000；2南开大学医学院，天津 300071

巨噬细胞是免疫系统中重要的组成成员，具有吞噬和抗原提呈等功能。根据不同活化方式及功能，巨噬细胞主要分为M1和M2两种表型[1]。M1型巨噬细胞又称经典活化的巨噬细胞，由LPS 等诱导产生，高表达NO和TNF-α，是具有促炎效应的细胞，可发挥免疫监视的作用。M2型巨噬细胞又称替代活化型巨噬细胞，由IL-4、IL-13和一些细胞因子等诱导产生，高表达Arg-1和CD206，是具有抑炎效应的细胞，在促进血管生成、肿瘤迁移侵袭等方面具有重要作用。近些年研究发现，多种天然药物可以介导巨噬细胞的M1/M2型极化，从而调控细胞的不同生理反应。

酸枣(ZizyphusjujubaMill.var.spinosa(Bunge)Hu ex H.F.Chow)为鼠李科枣属木本科植物。酸枣、酸枣仁和酸枣叶等产品都有很高的药用价值[2]，其中酸枣仁在镇静、安神、抗血压等方面疗效显著，而酸枣叶的研究相对较少。黄酮类化合物具有良好的抗炎、抗肿瘤、抗氧化等功效[3,4]。有文献报道，酸枣叶醇提物富含芦丁、槲皮素-3-O-α-L-(鼠李糖)(1→6)β-D-半乳糖等黄酮类物质[5]。本研究探究酸枣叶醇提物对巨噬细胞M1/M2型极化的影响，以期验证酸枣叶的药用功效。充分探究酸枣叶的功能及作用机制，将有利于综合开发利用天然药物资源，为抗炎、抗肿瘤治疗提供新的策略。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞系

小鼠单核巨噬细胞系RAW264.7由南开大学医学院王悦教授实验室馈赠，小鼠乳腺癌细胞系4T1购自武汉普诺赛生命科技有限公司。

1.1.2 实验药物与试剂

酸枣叶采自河北省承德市双桥区冯营子镇崔梨沟，酸枣叶醇提物由本校生物资源开发实验室提取，并用RPMI1640基础培养基配制为1 g/mL的储存液。胎牛血清(美国Gibco公司，批号：42F0266K)；RPMI1640培养基(以色列BI公司，批号：01-100-1A)；胰蛋白酶(以色列BI公司，批号：0032018)；青霉素-链霉素(以色列BI公司，批号：1831739)；脂多糖LPS(索莱宝，批号：L8880)；IL-4(索莱宝，批号：P00207)；CCK8试剂盒(碧云天，批号：C0042)；第一链cDNA合成试剂盒(诺唯赞，批号：R111-01/02)；NO试剂盒(南京建成，批号：A012-1-2)；引物(上海生工)。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养

小鼠单核巨噬细胞RAW264.7和小鼠乳腺癌细胞4T1均使用添加10%胎牛血清、1%青霉素-链霉素的RPMI1640基础培养基培养，置于37 ℃、5% CO2的培养箱中培养，取对数生长期的细胞进行后续试验。

1.2.2 CCK8法检测酸枣叶醇提物对RAW264.7 M1和M2型细胞的增殖影响

将RAW264.7细胞接种至96孔板，37 ℃ 5% CO2培养。M1型：细胞分为对照组、M1模型组、M1加药组(浓度分别为1.6、3.2、6.4 mg/mL)，每组设置三个复孔。M1模型组使用LPS处理12 h；加药组则药物预处理1 h，再LPS处理12 h。M2型：细胞分为对照组、M2模型组、M2加药组(浓度分别为1.6和3.2 mg/mL)。M2模型组使用20 ng/mL的IL-4诱导培养48 h；加药组先用IL-4诱导36 h，再加入药物共培养12 h。上述分组处理完毕后，移除原培养基，加入含 10% CCK8 溶液的培养基，37 ℃孵育4 h，酶标仪检测450 nm波长处OD值，并计算不同处理组的细胞活力。实验重复三次。

细胞存活率=(OD实验组-OD空白组)/

(OD对照组-OD空白组)×100%

1.2.3 Griess法检测酸枣叶醇提物对RAW264.7 M1型细胞NO分泌的影响

将RAW264.7细胞以2×105个/孔的密度接种至12孔板，分组处理同“1.2.2”。药物预处理1 h，LPS作用12 h后，收集细胞上清液，3 000 rpm离心20 min。取上清100 μL，使用Griess试剂盒测定各组NO含量，利用紫外分光光度计测定550 nm波长处的OD值。实验重复三次。

1.2.4 RT-PCR法检测酸枣叶醇提物对RAW264.7 M1和M2型细胞因子表达的影响

将RAW264.7细胞接种至12孔板，分组处理方式同“1.2.2”。用Trizol裂解细胞，提取各组细胞总RNA，逆转录得到cDNA，再以cDNA为模板进行PCR扩增。扩增产物在1.5%琼脂糖凝胶中电泳，GelRed染色后利用凝胶成像系统观察，并用ImageJ软件对电泳条带进行灰度分析。实验重复3次。采用β-actin为内参，M1型细胞目的基因为IL-12p40、IL-1β、COX-2，M2型细胞目的基因为Arg1和CD206。引物序列见表1。

1.2.5 细胞划痕实验检测酸枣叶醇提物对4T1细胞迁移能力的影响

1.2.5.1 条件培养基的制备

将RAW264.7细胞以2×105个/孔的密度接种至12孔板，37 ℃ 5% CO2培养。将细胞分为对照组、M2模型组、M2加药组(浓度分别为1.6和3.2 mg/mL)。对照组细胞仅用完全培养基培养；M2模型组细胞用含20 ng/mL的IL-4的完全培养基培养36 h后，再加入含IL-4的无血清培养基培养12 h；M2加药组细胞先用IL-4诱导培养36 h后，再加入药物与含IL4的无血清培养基共培养12 h。收集各组细胞上清，3 000 rpm离心20 min，即可得到四组条件培养基(conditioned medium，CM)。收集的条件培养基可直接用于实验或保存于-80 ℃。

表1 引物序列和产物长度

1.2.5.2 划痕实验

将4T1细胞以2×105个/孔的密度接种至12孔板，37 ℃ 5% CO2培养。待4T1细胞铺满后，用吸管尖端在12孔板底部轻划一条力度和角度一致、粗细均匀的直线，弃除原有培养基，用PBS洗两次。向各孔中加入添加4%血清的不同组别的条件培养基，置于细胞培养箱中培养。倒置显微镜下观察0和12 h的划痕距离并拍照，每样品随机选取3个视野，计算细胞迁移能力。

1.2.6 RT-PCR法检测4T1细胞中MMP-2、MMP-9及NF-κBp65的表达变化

将4T1细胞以2×105个/孔的密度接种至12孔板，37 ℃ 5% CO2培养24 h后，向各孔中加入添加4%血清的不同组别的条件培养基继续培养24 h。收集细胞，提取总RNA进行RT-PCR的检测。实验重复3次。采用β-actin为内参，4T1细胞目的基因为MMP-2、MMP-9以及NF-κBp65。

1.2.7 统计学处理

应用 SPSS 19.0 软件进行统计学处理，显著性水准P<0.05。

2 结果

2.1 酸枣叶醇提物不影响RAW264.7 M1和M2型细胞的增殖

如图1显示，在对照组、LPS诱导的M1模型组以及1.6～6.4 mg/mL浓度酸枣叶醇提物处理组中，RAW264.7细胞存活率无明显变化(P>0.05)；在对照组、IL-4诱导的M2模型组以及1.6～3.2 mg/mL浓度酸枣叶醇提物处理组中，细胞增殖不受影响(P>0.05)。可见，在上述浓度范围内，该药物无细胞毒性。

2.2 酸枣叶醇提物抑制RAW264.7M1型细胞NO的释放

由图2可知，与对照组相比，LPS诱导的M1模型组细胞中NO释放量明显上升(P<0.05)。与M1模型组相比，酸枣叶醇提物在3.2～6.4 mg/mL浓度范围内显著下调NO释放水平(P<0.05)，而在1.6 mg/mL无统计学意义(P>0.05)。NO释放量在1.6～6.4 mg/mL酸枣叶醇提物浓度范围内呈现明显的浓度依赖性。

表2 引物序列和产物长度

图1 酸枣叶醇提物对M1、M2型巨噬细胞增殖的影响

2.3 酸枣叶醇提物抑制M1型巨噬细胞极化

采用RT-PCR检测RAW264.7细胞中M1型细胞因子IL-12p40、IL-1β和COX-2的表达。结果如图3所示，与对照组相比，LPS诱导的M1模型组显著上调了上述基因的mRNA表达水平(P<0.05)，不同浓度处理的酸枣叶醇提物则可以抑制IL-12p40、COX-2和IL-1βmRNA表达(P<0.05)。并且IL-12p40和COX-2的表达在1.6～6.4 mg/mL酸枣叶醇提物浓度范围内存在剂量依赖关系，而IL-1β的表达在最低浓度1.6 mg/mL就被完全抑制。

2.4 酸枣叶醇提物抑制M2型细胞因子表达

RT-PCR检测RAW264.7细胞中M2型细胞因子Arg1和CD206的mRNA水平。结果表明，与对照组相比，IL-4诱导的M2模型组中标志基因的表达显著上调(P<0.05)，表示M2型巨噬细胞诱导成功；而加药组Arg1和CD206的表达均被显著抑制，且在1.6～3.2 mg/mL浓度范围内呈现出良好的浓度依赖关系。

图2 酸枣叶醇提物对RAW264.7细胞中NO释放的影响

图3 酸枣叶醇提物对M1型细胞因子IL-12p40、IL-1β和COX-2表达的影响

2.5 酸枣叶醇提物通过M2型巨噬细胞抑制4T1细胞迁移

采用划痕实验检测4T1细胞迁移情况。图5中，与对照组相比，M2型巨噬细胞上清处理4T1细胞12 h时，划痕宽度明显变窄，细胞迁移能力显著增强(P<0.05)；3.2 mg/mL酸枣叶醇提物处理的M2型巨噬细胞上清则明显阻碍划痕的愈合，从而抑制4T1细胞的迁移能力(P<0.05)。

图5 酸枣叶醇提物通过M2型巨噬细胞对4T1细胞迁移的影响

2.6 酸枣叶醇提物通过M2型巨噬细胞抑制4T1细胞迁移相关基因的表达

RT-PCR检测迁移相关基因的表达。如图6所示，与对照组相比，M2 型巨噬细胞上清处理4T1细胞24 h 时，MMP-2和MMP-9和NF-κBp65的mRNA表达量显著增加(P<0.05)；而各剂量组的酸枣叶醇提物均可通过M2型巨噬细胞显著下调MMP-2、MMP-9和NF-κBp65mRNA的表达(P<0.05)，且存在剂量依赖关系。

3 讨论

巨噬细胞具有较强的吞噬和抗原提呈等免疫功能，可在不同条件下被诱导分化成为M1型和M2型巨噬细胞。LPS可以促进炎症因子的释放，同时启动iNOS 转录，释放 NO，促使巨噬细胞向 M1 型极化[6,7]，从而介导巨噬细胞的炎症反应[8,9]。本研究发现M1模型组的IL-12p40、IL-1β和COX-2 mRNA表达量与对照组相比大幅度提升，NO分泌量也显著增多。而M1加药组在1.6～6.4 mg/mL酸枣叶醇提物浓度范围内，上述炎症因子的mRNA表达量和NO含量均呈现出不同程度的下降趋势，表明酸枣叶醇提物可显著抑制巨噬细胞的M1型极化。

图6 酸枣叶醇提物通过M2型巨噬细胞对4T1细胞中MMP-2、MMP-9和NF-κBp65 mRNA表达的影响

巨噬细胞经IL-4、IL-10、肿瘤细胞相关因子等诱导可得到M2型巨噬细胞。其高表达精氨酸酶I(Arg1)、甘露糖受体(mannose receptor，MR/CD206)等细胞因子，可促进组织修复，抑制肿瘤细胞生长转移等免疫过程[10,11]。本实验结果表明M2模型组中标志基因Arg1和CD206的表达较对照组显著提升。而M2加药组在1.6～3.2 mg/mL酸枣叶醇提物浓度范围处理时，二者的mRNA表达量均明显降低，且呈现较好的浓度依赖性。表明该药物不仅可抑制M1型极化，对M2型的诱导也有较强的抑制作用。

在肿瘤微环境中，M2型巨噬细胞作为其中主要的基质细胞，可以通过分泌多种细胞因子、趋化因子来促进肿瘤细胞的迁移侵袭[12]。有研究表明多种天然药物可通过逆转M2型巨噬细胞的极化来抑制肿瘤细胞的迁移[13]。本研究进一步从肿瘤微环境的角度，探究酸枣叶醇提物通过调节巨噬细胞的极性对肿瘤细胞迁移的影响，从而深入阐释酸枣叶醇提物的药用功效。M2型巨噬细胞参与肿瘤转移的途径之一为：释放多种基质金属蛋白酶MMP-2、MMP-9等，降解细胞外基质，从而促进新生血管的建立，参与肿瘤转移[14]。MMP-2和MMP-9在维持降解和重塑细胞外基质的动态平衡过程中发挥着重要作用[15]，抑制MMP活性是肿瘤治疗的又一新靶点[16]。MMP-2和MMP-9是NF-κB信号通路下游相关蛋白。NF-κB是细胞内重要的核转录因子，NF-κBp65 是该家族成员中重要的功能性亚单位[17]。有许多研究报道NF-κB对肿瘤侵袭迁移非常重要，其机制之一为转录调控迁移相关基因的表达[18,19]。一些天然化合物如姜黄素和槲皮素，可以靶向 NF-κB的活性来抑制乳腺癌转移[20]。本研究发现酸枣叶醇提物处理的M2型巨噬细胞上清可明显阻碍划痕的愈合，显著抑制4T1细胞的迁移能力。其机制可能是通过抑制NF-κB信号通路来降低细胞迁移相关基因MMP-2和MMP-9的表达。

综上所述，酸枣叶醇提物不仅能够抑制巨噬细胞的M1型极化，具有良好的抗炎活性；还可以抑制M2型细胞因子的表达，调控M2型巨噬细胞极化，并进而通过NF-κB信号通路阻滞4T1乳腺癌细胞的迁移。以上研究可以为酸枣叶作为保健、治疗药物提供可靠依据。