不同立地条件沙田柚果园土壤微生物多样性分析

彭玉娇 崔学宇 谭梦超 阮红燕 邵元元 曾文萍 区燕丽 侯彦林

摘要：【目的】分析不同立地條件沙田柚果园土壤微生物多样性，为沙田柚的精准施肥和精细管理提供参考依据。【方法】以广西容县沙田柚果园五一柚场为研究对象，测定该区域不同立地条件（坡向和坡位）土壤的基础理化性质（总氮、水分含量和pH），同时利用高通量测序技术对其微生物群落结构及多样性进行分析。【结果】土壤样本共获得37806个操作分类单元（OTUs），至少涵盖46门57纲136目270科661属的细菌;门水平聚类分析结果表明，沙田柚种植土壤与对照（未种植沙田柚的空地）间能明显区分开，变形菌门（Proteobacteria）和拟杆菌门（Bacteroidetes）是沙田柚种植土壤的优势菌门; Chujaibacter是沙田柚种植土壤微生物的优势属，但其相对丰度在不同坡向和坡位差异较明显，北坡向（25.77%）和下坡位（16.86%）相对丰度最高，而东坡向（5.26%）和上坡位（5.58%）较低;Pseudomonas cichorii是沙田柚种植潜在的致病种。土壤理化性质分析发现，坡位仅对土壤水分含量产生显著影响（P<0.05，下同），下坡位水分含量最高（58.25%），上坡位最低（47.00%），二者间差异显著;坡向是影响沙田柚种植土壤总氮、水分和pH的主要因素，其中，西坡向土壤水分含量最高（63.00%）、南坡向最低（42.67%），南坡向pH最高（6.60）、东坡向最低（5.90），北坡向土壤的总氮含量最高（2.07 g/kg）、南坡向最低（1.77 g/kg）。土壤水分含量影响土壤微生物4个属和5个种，总氮含量影响2个属和2个种，而pH对土壤微生物结构未产生显著影响（P>0.05）;另有3个属和2个种的微生物可能与沙田柚品质相关。【结论】坡向对沙田柚种植土壤的理化性质影响较大，沙田柚种植影响土壤细菌群落组成，坡向和坡位造成沙田柚果园土壤细菌群落组成差异。

关键词： 沙田柚;立地条件;微生物群落结构;高通量测序技术

中图分类号： S155.46                   文献标志码： A 文章编号：2095-1191（2020）05-1136-09

Abstract：【Objective】The soil microbial diversity of Shatian pomelo orchard was analyzed under different site conditions to provide reference for precise fertilization and disease control of Shatian pomelo. 【Method】Taking the Wuyi pomelo orchard in Rongxian County of Guangxi as the object，the basic physical and chemical properties （total nitrogen，water content and pH） of soil under different site conditions（slope direction and position） were analyzed. Meanwhile，the microbial community structure and diversity analysis were carried out by high-throughput sequencing technology. 【Result】The results showed that the total number of operational taxonomic unit（OTUs） obtained in this study was 37806，including least 46 phyla，57 classes，136 orders，270 families and 661 genera. The cluster analysis at phyla level indicated that the soil cultivating Shatian pomelo orchard and control（with no Shatian pomelo） could be separated easily.  Proteobacteria and Bacteroidetes were dominant bacteria populations at phylum level. Chujaibacter was the dominant genus of soil microbe in Shatian pomelo orchard，but its relative abundance varied greatly in different slope directions and positions，the relative abundances of north slope direction（25.77%） and lower slope（16.86%） were higher，those of east slope direction（5.26%） and upper slope（5.58%） were  lower.  Pseudomonas cichorii was a potential pathogen in Shatian pomelo cultivation. Analysis of soil physical and chemical properties showed that slope position significantly affected water content（P<0.05， the same below）， the highest water content（58.25%） was in the lower slope，the lowest（47.00%） was in the upper slope， and the difference between the two was significant. The slope direction affected soil total nitrogen， water content and pH，among which the soil water content in the north slope was the highest（63.00%），the south slope was the lowest （42.67%），the pH value in the south slope was the highest（6.60），the east slope was the lowest（5.90）， the total nitrogen content in the north slope was the highest（2.07 g/kg），and the south slope was the lowest（1.77 g/kg）. Soil water content affected 4 genera and 5 species of soil bacteria，total nitrogen content affected 2 genera and 2 species，pH had no significant effects on soil microbial community composition（P>0.05）; and 3 genera and 2 species of soil bacteria might be rela-ted to the quality of Shatian pomelo. 【Conclusion】This study demonstrates that the slope direction factor has great influence on the physical and chemical properties of Shatian pomelo cultivating soil. The cultivation of Shatian pomelo affects the soil microbial community composition. The slope direction and position contribute a lot to the differences of soil microbial community composition in Shatian pomelo orchard.

Key words： Citrus maxima（Burm.） Merr.cv. Shatian Yu; site condition; microbial community structure; high throughput sequen-cing technology

Foundation item： Guangxi Major Science and Technology Project（Guike AA17204077）; Guangxi Construction Project of First-class Discipline（Geography）（2019）; Open project Key Laboratory of Environmental Change and Resource Utilization of Beibu Gulf of Ministry of Education（GTEU-KLOP-X1820，GTEU-KLOP-X1819）

0 引言

【研究意义】沙田柚[Citrus maxima（Burm.） Merr.cv. Shatian Yu]隶属于芸香科柑橘属，分布于我国广西、广东、四川和重庆等地（郭淑敏等，2010），是一种适应性强、种植范围广且经济效益高的果树（区善汉等，2015）。本课题组前期研究发现，不同栽培立地条件的沙田柚品质存在明显差异，因沙田柚品质直接影响其商品果率，进而影响栽培经济效益（彭玉娇等，2019）。沙田柚的栽培中，土壤—微生物—果树三者之间相互作用、相互影响，构成了沙田柚根际生长的微生态系统。因此，对沙田柚不同栽培立地条件土壤微生物多样性进行研究，有助于通过人工调节果园土壤微环境，解决地力衰退和潜在土传病害等问题，对沙田柚精准施肥和精细管理有重要意义。【前人研究进展】近年来，关于沙田柚的研究主要集中在采后贮藏，包括采后不同贮藏方式下风味物质的变化（刘顺枝等，2010;刘萍等，2016a，2016b）、采后风味物质含量测定（阳梅芳等，2013）和采后品质变化模型建立（许曦戈等，2018）等，沙田柚果园土壤的研究多集中在氮、磷、钾含量变化及有机肥施用等（李涵，2016），但从微生物多样性及功能角度进行的研究鲜有报道。随着测序技术的发展，已有较多关于微生物在土壤中的功能研究，且证实土壤微生物群落结构受土壤理化性质的影响（Brockett et al.，2012;Ramirez et al.，2012;Sun et al.，2015），同时群落差异也是林木地力衰退的重要原因之一（Tan et al.，2017a，2017b）。不同的立地条件直接影响光照、温度及土壤质地等因子，导致土壤养分和微生物的差异（雷斯越等，2019;张倩等，2019）。此外，作物的品种和健康状况等对土壤微生物群落结构也有直接影响（Luan et al.，2015;生静雅等，2017）。【本研究切入点】目前从土壤生态角度来看，沙田柚种植土壤微生物群落结构及沙田柚种植果园的坡向、坡位与土壤微生物群落间的关系尚不清晰，也鲜有相关研究报道。【拟解决的关键问题】测定沙田柚果园不同坡向和坡位的土壤理化性质（水分含量、pH及总氮含量），同时利用16S rDNA V4区域扩增子测序方法对土壤微生物群落进行研究，旨在明确沙田柚果园土壤与微生物群落结构的关系，为沙田柚果园的精准管理提供理论依据。

1 材料与方法

1. 1 研究区域概况

试验基地五一柚场位于广西玉林市容县容州镇（东经111°19′，北纬22°33′，最高海拔151 m），属亚热带季风气候，土壤为砖红壤，年降水量约1700 mm。柚场占地10 ha，种植2000株同一品种的20～30年生成熟沙田柚果树。

1. 2 样地选取与土样采集

2019年3月16日采集土壤，在果园按方位分为东、南、西和北坡向，同时在山顶定点，将山分为上、中和下坡位，将山划分为12个部分，每部分随机选取果树1株，去除地表落物等覆盖物，在树冠范围内按五点法取土样，取土深度10～20 cm;在未种植沙田柚的空地随机选择3个地点，同样按照五点法取土样为对照（CK）。

1. 3 测定方法

1. 3. 1 土壤理化性质测定 土壤pH采用便携式土壤pH计进行测定，水分含量利用便携式土壤水分仪进行测定，总氮含量采用土壤总氮试剂盒[齐一生物科技（上海）有限公司]进行测定。

1. 3. 2 基因组DNA提取和PCR扩增 采用CTAB法对土壤样本基因组DNA进行提取，之后利用无菌水稀释样本至1 ng/μL，委托北京诺禾致源生物信息科技有限公司完成对应区段的PCR扩增及后续测序。以稀释后的基因组DNA为模板，根据测序区域的选择，使用带Barcode的特异引物、New England Biolabs公司的Phusion? High-Fidelity PCR Master Mix with GC Buffer和高效高保真酶进行PCR扩增，确保扩增效率和准确性。PCR扩增产物使用2%琼脂糖凝胶进行电泳检测;根据PCR扩增产物浓度进行等量混样，充分混匀后使用1×TAE 2%琼脂糖胶电泳纯化PCR扩增产物，剪切回收目标条带，使用Thermo Scientific公司GeneJET胶回收试剂盒进行回收。使用Thermofisher公司的Ion Plus Fragment Library Kit 48 rxns建庫试剂盒进行文库构建，经Qubit定量和文库检测合格后，再采用Thermofisher公司的Ion S5TMXL进行上机测序。

1. 4 数据处理

使用Qiime 1.9.1计算Observed-otus、Chao1、Shannon、Simpson、ACE、Goods-coverage和PD_ whole_tree指数，利用R 2.15.3绘制稀释曲线（Rare-faction curve）、Rank abundance曲线和物种累积曲线，并进行Alpha多样性指数组间差异分析，试验数据处理利用Excel 2016录入，SPSS 23.0计算。

2 结果与分析

2. 1 沙田柚果园土壤微生物群落多样性分析结果

样品扩增共获得原始序列1198119条，对低质量序列过滤后，获得有效序列1134750条，占94.71%，合计获得碱基数目为287579486 nt，有效序列长度平均值为253 nt，得到操作分类单元（OTU）37806个，至少涵盖46门57纲136目270科661属;对于各样本，OTU在1926～3146个，OTU最多的是南中，除对照外，最少的是东下（表1）。ACE指数和Chao1指数反映微生物群落的丰富度，由表1可知，南上、南中和西上的ACE指数和Chao1指数较大;群落物种多样性由Simpson指数和Shannon指数反映，各坡向和坡位的Simpson指数差异小，在0.97～0.99，而Shannon指数同样是南上、南中和西上较大。这一结果体现了坡向和坡位对细菌多样性的影响。

稀释曲线表示在样本中随机抽取一定测序量的数据，对其代表的OTUs进行统计所构建获得的曲线，当稀释曲线趋向平缓时，表明测序量合理。15个土壤样本稀释曲线如图1所示，各稀释曲线逐渐趋于平缓，表明本研究测序量合理，增大数据量只会产生少量新物种OTUs。

对所有样本进行均一化处理后，绘制Venn图（图2）。由图2-A可知，4个坡向包含的OTU数量分别为东坡向3252个、西坡向3883个、南坡向4101个和北坡向3282个，对照为3823个;其中1991个OTUs为4个坡向共有，即每个坡向均有接近50%的OTUs相同;东、南、西、北坡向特有的OTUs分别为215、512、385和228個。由图2-B可知，上、中、下3个坡位包含的OTUs分别为4321、4340和3597个;其中2716个OTUs为3个坡位共有，即每个坡位均有超过60%的OTUs相同。对于每个坡位来说，上坡位特有的OTUs数量最多（611个），下坡位最少（210个）。

2. 2 沙田柚果园土壤优势菌群落分布情况

2. 2. 1 细菌门分类水平比较及聚类分析 为明确样本间的相似性，对样本进行聚类分析，结果（图3）表明，不论按照坡向还是坡位划分，对照土壤和沙田柚种植区域土壤细菌均被分为两大类;根据坡向划分，南坡向和西坡向样本聚在一个类群中（图3-A）;根据坡位划分，下坡位和中坡位样本聚在一个类群中（图3-B）。

所有土壤样本共获得46个门，以变形菌门（Proteobacteria）的相对丰度最高，其在对照及西、北、南、东4个坡向土壤样本中的相对丰度分别为31.11%、51.41%、62.92%、48.94%和49.21%，在上、中、下3个坡位土壤样本中的相对丰度分别为49.93%、54.82%和54.57%;不同立地条件间比较发现，北坡向土壤的变形菌门相对丰度高于其他组别。其次是拟杆菌门（Bacteroidetes），其在对照及西、北、南、东4个坡向土壤中相对丰度分别为19.79%、11.72%、10.67%、13.91%和27.13%，在上、中、下3个坡位土壤中的相对丰度分别为17.36%、13.76%和16.48%;不同立地条件间比较发现，东坡向土壤的拟杆菌门相对丰度远高于其他组别。其余在各土壤样本中相对丰度较高的菌门分别是厚壁菌门（Firmicutes）、酸杆菌门（Acidobacteria）、放线菌门（Actinobacteria）、芽单胞菌门（Gemmatimonadetes）、绿弯菌门（Chloroflexi）和疣微菌门（Verrucomicrobia）等。

2. 2. 2 细菌属分类水平比较 对土壤样本细菌属分类水平进行分析，结果发现沙田柚种植土壤全部细菌序列至少有661个属，选取相对丰度前30的属比较作图。除去其他（Others）外，相对丰度最高的属是Chujaibacter，其在对照及西、北、南、东4个坡向样本中的相对丰度分别为7.32%、9.46%、25.77%、9.88%和5.26%（图4-A），在上、中、下3个坡位样本中的相对丰度分别为5.58%、15.37%和16.86%（图4-B）。其次是产黄杆菌属（Rhodanobacter），其在对照及西、北、南、东4个坡向样本中的相对丰度分别为0.20%、7.60%、4.47%、5.06%和9.99%，对照土壤的相对丰度明显低于沙田柚种植土壤;在上、中、下3个坡位样本中的相对丰度分别为4.29%、6.84%和10.55%。土地杆菌属（Pedobacter）同样在沙田柚种植土壤中相对丰度更高，其在对照及西、北、南、东4个坡向样本中的相对丰度分别为0.10%、1.45%、2.93%、1.19%和7.58%;在上、中、下3个坡位样本中的相对丰度分别为2.87%、2.28%和4.63%。此外，乳酸菌属（Lactobacillus）和乳球菌属（Lactococcus）在对照土壤中的相对丰度远高于沙田柚种植土壤，尤其是乳球菌属在对照土壤中的相对丰度为1.58%。

2. 3 沙田柚土壤样本高丰度微生物潜在功能分析结果

对沙田柚种植土壤和对照土壤相对丰度较高（相对丰度>0.10%）的属、种进行分析，共获得81个属和31个种。对沙田柚种植土壤和对照土壤样本微生物属进行分析发现，有6个植物病原菌重要的属（冯洁，2017）在沙田柚种植土壤中被发现，分别为假单胞菌属（Pseudomonas）、红球菌属（Rhodococcus）、芽孢杆菌属（Bacillus）、链丝（霉）菌属（Streptomyces）、雷尔氏菌属（Ralstonia）和节杆菌属（Arthrobacter），未发现柑橘黄龙病的韧皮杆菌属（Liberobacter）。与对照相比，沙田柚种植土壤中高丰度的潜在致病种主要是Pseudomonas cichorii（Trantas et al.，2013）。对沙田柚种植土壤潜在固氮微生物进行分析发现，有3个潜在固氮菌属的相对丰度较高，分别为黄杆菌属（Flavobacterium）、假单胞菌属和脱硫弧菌属（Desulfovibrio），其中黄杆菌属和假单胞菌属相对丰度明显高于对照。在对照土壤样本中发现脱硫肠状杆菌属（Desulfotomaculum），但在沙田柚种植土壤中未发现。此外，硝化细菌Pseudomonas xanthomarina（Sope?a et al.，2014）、丁草胺降解菌Flavobacterium yanchengense（Hu et al.，2013）和烷烃降解菌香茅醇假单胞菌Pseudomonas citronellolis（Bhattacharya et al.，2003）在所有沙田柚种植土壤中的相对丰度也远高于对照土壤，可能与施用肥料及除草剂有关。

2. 4 环境因子对沙田柚土壤微生物的影响

对沙田柚种植土壤中的水分含量、pH和总氮含量进行测定，结果如表2和表3所示。坡向是影响土壤属性的主要因素，对于不同坡向来说，西坡向土壤水分含量最高，显著高于东坡向、南坡向和对照（P<0.05，下同），与北坡向间差异不显著（P>0.05，下同），南坡向最低;南坡向土壤的pH最高，显著高于东坡向和对照，对照土壤的pH最低;北坡向土壤的总氮含量最高，显著高于东坡向、南坡向和对照，而对照的总氮含量最低。对于不同坡位来说，坡位仅对土壤水分含量有显著影响，上坡位土壤水分含量最低，下坡位最高。分析沙田柚种植土壤微生物与环境因子的相关性发现，土壤水分含量影响土壤微生物4个属和5个种，总氮含量影响2个属和2个种，而pH对土壤微生物结构未产生显著影响;此外，有3个属和2个种的微生物可能与沙田柚品质相关（图5）。

3 讨论

已有研究表明，土壤微生物以细菌为主（Yang et al.，2010），土壤中的微生物群落与外界环境存在相互作用（魏赛金等，2016;王楠楠等，2017;徐琳等，2017;张文锋等，2018）。因此，本研究以细菌为切入点，对沙田柚种植土壤细菌多样性进行分析，15个土壤样本的稀释曲线趋于平缓，证明本研究测序量合理。对OTU分析结果表明，沙田柚种植土壤和对照土壤细菌结构有一定差异。对沙田柚种植土壤样本之间的OTU进行分析发现，南坡向和上坡位土壤特有的OTU数量最多。

在门水平上对土壤微生物多样性进行聚类分析发现，对照土壤和沙田柚種植土壤样本被划分到两个大类中;对于坡向，西坡向和南坡向聚为一个类群，对于坡位，下坡位和中坡位聚为一个类群。变形菌门在所有的样本中相对丰度最高，但在样本间差异较明显，对照的相对丰度最低;对于坡向，北坡向的相对丰度最高，南坡向最低;对于坡位，中坡位的相对丰度最高，上坡位最低。变形菌门相对丰度高于对照土壤的结果与前人在雷竹林（翟婉璐等，2017）、苹果园（沈鹏飞等，2019）土壤中的研究结果相似。究其原因可能是变形菌门为富养菌（王慧颖等，2018;张凯煜等，2019），坡向间的差异由北坡向的总氮含量最高所致;从坡位角度分析，可能由于地势的原因，水分在中、下坡位较高，溶解于水的营养富集在中、下坡位，故中、下坡位的变形菌门丰度高于上坡位。在属水平上对土壤微生物多样性进行分析发现，沙田柚的种植明显提高土壤中产黄杆菌属和土地杆菌属的相对丰度，降低乳酸菌属和乳球菌属的相对丰度。说明植物的自身代谢、微生物的主动选择及栽培种植管理均影响土壤细菌的菌群结构，也可能是沙田柚种植土壤营养更丰富所致。

本研究对沙田柚种植土壤微生物相对丰度较高的种、属潜在功能进行分析，发现Pseudomonas  cichorii在沙田柚种植土壤中有较高的相对丰度，其在多种植物中有致病的报道（Cottyn et al.，2009;Tateda et al.，2009;Trantas et al.，2013;Moreira et al.，2015），因此需注意其对沙田柚产生病害危害的潜在风险。硝化细菌在沙田柚种植土壤中的相对丰度远高于对照，该菌的存在可能降低沙田柚种植土壤的氮肥利用率。此外，丁草胺降解菌（胡钢，2013;Hu et al.，2013）和烷烃降解菌香茅醇假单胞菌（Bhattacharya et al.，2003;陈道康，2016）在沙田柚种植土壤中的相对丰度提高，可能是自然状态下对土壤除草剂污染修复所致，推测这两种菌具有潜在修复土壤除草剂污染的利用价值。

本研究对沙田柚种植的环境因子进行测定分析，发现坡向是影响沙田柚种植土壤氮、水和pH的主要因素，可能是因为沙田柚种植土壤海拔不高且为梯田所致。pH未对沙田柚种植土壤微生物结构产生显著影响;同时发现3个属和2个种在不同品质沙田柚种植土壤中存在显著差异，但其具体机理有待进一步研究。

4 结论

坡向对沙田柚种植土壤的理化性质影响较大，沙田柚种植影响土壤细菌群落组成，坡向和坡位造成沙田柚果园土壤细菌群落组成差异。

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（責任编辑 罗 丽）