纤维素/海藻酸钠复合气凝胶的表面功能化与仿生矿化

査 莉， 王璐瑶， 郑雅慧， 车剑飞

（南京理工大学化工学院，南京 210094）

骨修复材料的多孔结构对其生物活性具有重要意义，它不仅能为骨细胞和纤维细胞提供生长空间和通道，以便血管长入；而且可以使长入组织形成机械卯合，增强彼此的结合[1,2]。纤维素水凝胶兼具生物降解性和生物相容性。采用冷冻干燥或超临界干燥方法[3-5]，可以得到用气体代替凝胶内部液体而不发生孔洞坍塌的三维网络结构气凝胶，其理想的多孔结构支架使其广泛应用于骨组织工程领域。以纤维素气凝胶为支架，在其表面沉积羟基磷灰石（HA），已经成为骨组织工程材料研究和应用领域的一个热点[6]。各种支架表面官能团诱导磷灰石的生长能力依次为PO4H2＞COOH＞＞CONH2/OH＞NH2＞＞CH3[7]。纤维素气凝胶表面的HA 成核能力较弱，反应活性不佳，所以需要通过接枝各种官能团进行化学改性增强其矿化能力。为了使HA 更好地沉淀在纤维素支架上，Favi 等[8]使用激光图案化技术制备了蜂窝状细菌纤维素支架，并采用高碘酸盐氧化法对细菌纤维素支架进行了改性。Safwat 等[9]用2, 2, 6, 6-四甲基哌啶-1-氧基自由基（TEMPO）/NaBr/NaClO 选择性氧化体系氧化纳米纤维素，通过掺入双相磷酸钙进行矿化得到骨修复材料。

海藻酸钠（SA）具有较强的亲水性，将它与纤维素（Cellu）混合，可利用两者亲水性差异制备大孔材料[10]。本文以Cellu/SA 复合气凝胶作为支架模板，在进一步对Cellu/SA 复合气凝胶以高碘酸钠和亚氯酸钠进行2 次氧化后，制得的羧基化纤维素/海藻酸钠（COOH-Cellu/SA）复合气凝胶具有更大的比表面积、更丰富的表面羧基基团。与改性前相比，改性复合气凝胶的生物矿化效率明显提高，并且无毒性，能够很好地促进细胞生长、分化。

1 实验部分

1.1 原料和试剂

纤维素、海藻酸钠：北京百灵威科技有限公司；NaIO4：分析纯，上海麦克林生化科技有限公司；CH3COOH、NaClO2、NaCl、NaHCO3、KCl、K2HPO4·3H2O、MgCl2·6H2O、CaCl2、Na2SO4、三（羟甲基）氨基甲烷（Tris）、尿素（Urea）、环氧氯丙烷（ECH）、乙二醇：分析纯，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；去离子水：实验室制备；盐酸：分析纯，上海凌峰化学试剂有限公司。

1.2 测试与表征

采用日本岛津公司FTIR-8400S 型傅里叶红外光谱仪（FT-IR）进行红外光谱测试，测量范围为4 000～400 cm-1；采用日本电子株式会社JSM-7600F 型超高分辨热场发射扫描电镜（SEM）对气凝胶进行观测；采用德国BRUKER 公司D8 ADVANCE 型X 射线衍射仪（XRD），使用Cu 靶，在电压为40 kV、电流为40 mA、衍射范围2θ 为10°～70°的条件下对矿化气凝胶进行XRD 测试；采用日本纳米表面分析仪器公司PHI5300 型X射线光电子能谱仪（XPS），以Al Kα 单色射线为激发源（能量分辨率小于0.6 eV）对矿化气凝胶进行测试；采用杜尔料改良伊格尔（DMEM）高糖培养基在恒温细胞培养箱中培养小鼠成纤维（L929）细胞，并在一定条件下加入气凝胶浸提液，利用细胞计数试剂盒测定（CCK8）法进行细胞活性实验，并用活/死细胞染色实验（Live/Dead）的双染试剂在24、48、72 h 对细胞染色，采用日本尼康Ti2-E 型倒置荧光显微镜观察L929 细胞的形态结构以及活性。

1.3 实验步骤

1.3.1 化学氧化法制备COOH-Cellu/SA 气凝胶[10,11]配制NaOH-尿素-水（质量比为7∶12∶81）的混合碱溶液97 g，置于-18 ℃条件下预冷过夜。称取3 g 纤维素粉加入前述97 g 混合碱溶液中进行搅拌，直至溶液透明。另外再称取3 g 海藻酸钠粉加入97 g 常温碱溶液中搅拌，得到w=3%的海藻酸钠溶液。

首先在纤维素-海藻酸钠（质量比为7/3，总计10 g）混合溶液中加入1 mL 交联剂ECH，在室温下搅拌1 h，直至油滴状的ECH 完全消失；然后将其置于60 ℃烘箱中3 h 形成水凝胶，并在去离子水中熟化去除杂质；最后进行冷冻干燥，得到Cellu/SA 气凝胶。将0.15 g Cellu/SA 加入含0.3 g NaIO4的100 mL 蒸馏水中，25 ℃条件下避光搅拌48 h，然后添加过量的乙二醇，继续搅拌2 h，除去多余的NaIO4，用去离子水洗净，真空冷冻干燥72 h，得到醛基化复合气凝胶（CHO-Cellu/SA）。

将0.15 g CHO-Cellu/SA 浸入含有0.3 g NaClO2的CH3COOH 溶液中（100 mL，2 mol/L），并在25 ℃下搅拌72 h，得到COOH-Cellu/SA 气凝胶。

1.3.2 COOH-Cellu/SA 的矿化 矿化溶液的配制[12]步骤如下：在36.5 ℃恒温下，向1 000 mL 的塑料烧杯中依次加入NaCl（11.994 g），NaHCO3（0.525 g），KCl（0.336 g），K2HPO4·3H2O（0.342 g），MgCl2·6H2O（0.458 g），1.0 mol/L 的盐酸（60 mL），CaCl2（0.417 g），Na2SO4（0.107 g），Tris（9.086 g）并不断搅拌，保持pH 为7.42～7.45，直至Tris 加完。最终缓慢滴加盐酸调节pH 至7.40，即得到矿化溶液。该过程中不断搅拌，保持溶液恒温36.5 ℃，并清澈透明。将配好的矿化溶液移入1 000 mL 容量瓶定容，再转移至塑料烧杯中用塑料薄膜密封，冷藏备用。

将Cellu/SA、COOH-Cellu/SA 浸泡在0.1 mol/L 的CaCl2溶液中3 d 进行预矿化。每天更换CaCl2溶液。预矿化结束后，用去离子水轻轻冲洗再放入50 mL 的离心管中，加入矿化溶液，并在36.5 ℃恒温水浴锅中分别矿化3、5、7 d。矿化溶液每天更换1 次，矿化后的产物标记为Cellu/SA-Ca3D（5D、7D）、COOH-Cellu/SACa3D（5D、7D）。

2 结果与讨论

2.1 COOH-Cellu/SA 的合成

纤维素气凝胶表面的羟基诱导HA 的成核能力较弱，海藻酸钠的加入可以引入部分羧基，但难以满足高效矿化的要求。本文采用高碘酸钠和亚氯酸钠的2 次氧化法，在复合气凝胶表面引入羧基以增强其矿化能力，具体反应原理如图1 所示。在NaIO4的作用下，复合气凝胶中的纤维素和海藻酸钠的顺二醇C2 和C3 位置上的羟基发生断裂，与形成张力较小的环状络化物，最终得到含有醛基的CHO-Cellu/SA。再用NaClO2在醋酸的作用下对CHO-Cellu/SA 的醛基进行进一步氧化，最终醛基被进一步氧化为羧基[11,13]。

图1 2 次氧化Cellu/SA 复合气凝胶的机理Fig. 1 Mechanism of secondary oxidation modification of Cellu/SA composite aerogels

2.2 COOH-Cellu/SA 的XPS 分析

复合气凝胶中C1s 峰在氧化前后的高分辨率XPS 谱如图2 所示。C1s 结合能取决于碳和其他元素之间的键合情况。就C1s 峰而言，Cellu/SA 里通常包含了C―OH/C―C、C―O、C―O―C 和―COOR，结合能分别为284.5、286.5、287.8、288.9 eV[14]。经过氧化后，C―O 峰的强度呈下降趋势。相反，―COOR 峰的强度有增加的趋势。这表明，纤维素和海藻酸钠表面C2 和C3 位置的C―OH 被氧化为―COOH。表1 总结了氧化前后的复合气凝胶中C 基的峰面积和相对原子百分比。根据相应峰的高斯/洛伦兹拟合计算C 基的相对原子百分比可以看出，C―O、O―C―O 含量呈下降趋势，C―H/ C―C、―COOR 含量呈上升趋势。复合气凝胶经过改性后，―COOR 的峰面积由未改性复合气凝胶的3.83%增加到改性后的4.76%。但值得注意的是，过度的氧化会导致气凝胶结构破坏。

图2 Cellu/SA（a）和COOH-Cellu/SA（b）的C1s 峰高分辨XPS 能谱Fig. 2 High-resolution XPS spectra of C1s peaks in original composite aerogels （a） and dicarboxylic composite aerogel （b）

表1 Cellu/SA 和COOH-Cellu/SA 中C 基的峰面积和相对原子百分比Table 1 Peak areas and relative atomic percentage of C moieties in Cellu/SA and COOH-Cellu/SA

2.3 COOH-Cellu/SA 矿化的FT-IR 分析

气凝胶羧基化改性前后及其仿生矿化的红外谱图如图3 所示。CHO-Cellu/SA 气凝胶在1 730 cm-1处出现了醛基的―C=O 振动吸收峰，表明气凝胶表面被有效氧化[15]。COOH-Cellu/SA 气凝胶的―C=O 振动吸收峰明显增强，并向高波数移动（1 730 cm-1），表明气凝胶表面的醛基被氧化成羧基。但由于纤维素氧化后形成的羧基位置相邻，容易形成二缔合体，彼此间受到氢键的影响，与独立的羧基相比（1 770～1 750 cm-1），新出现的羧基吸收峰位置向低波数位移（1 735 cm-1）[16]。羧基化改性前后的气凝胶样品的红外光谱，在仿生矿化后都明显出现了HA 的磷酸盐特征峰（其中，550 cm-1和610 cm-1归属于O―P―O 的弯曲振动，930 cm-1归属于C―O―P 的拉伸振动）[17-19]。但相比于未改性的气凝胶样品，

图3 Cellu/SA 和COOH-Cellu/SA 仿生矿化的FT-IR 谱图Fig. 3 FT-IR spectra of biomineralized original composite aerogels and dicarboxylic composite aerogel

2.4 COOH-Cellu/SA 的生物矿化行为

图4 为复合气凝胶经过不同时间矿化后的XRD 图谱。通常纤维素Ⅰ和海藻酸钠分别在14.5°、15.9°、20.5°、22.7°、34.6°和14.0°、23.0°有衍射峰，然而在复合气凝胶的XRD 图谱并中没有观察到相应的衍射峰，这可能是由于凝胶形成过程中，交联剂在纤维素和海藻酸钠之间形成了有效化学交联，保证了两者的均匀混合，阻止了纤维素和海藻酸钠各自的结晶行为，从而形成了非晶态复合气凝胶[10]。羧基化改性前后的样品，仿生矿化后均在31.9°和45.0°处出现了对应于HA 的晶体平面（211）和（222）特征峰[20]。但与未改性复合气凝胶的矿化样品相比，羧基化复合气凝胶在同样矿化3 d 后表面已经能观察到HA 晶体的特征峰，且7 d 后的HA 晶体特征峰更加尖锐。这意味着羧基化复合气凝胶表面HA 晶体的沉积速率更快。这是因为羧基化复合气凝胶表面的羧基含量更丰富，电负性更强，可以提供更多的配合位点与 Ca2+络合。

图4 矿化气凝胶的XRD 谱图Fig. 4 XRD pattern of the mineralized aerogels

2.5 COOH-Cellu/SA 矿化的形貌和XPS 分析

图5 所示为气凝胶经过仿生矿化7 d 后样品表面Ca-P 矿化物的SEM 形貌以及其XPS 图谱。图5（a）为Cellu/SA-Ca7D 一个代表孔洞的低放大倍率SEM 照片，可以观察到其大孔套小孔，平均孔径为500 μm，有利于成骨细胞的附着及矿化物质的传递[21]。经放大后的SEM 照片（图5（b，c））显示，在矿化溶液中浸泡7 d 后，在改性前后的两种气凝胶表面均清晰地观察到颗粒沉积。这是由于气凝胶的表面官能团如―OH 和―COOH 都具有结合 Ca2+形成原子核的能力，可以诱导Ca2+吸附在气凝胶表面。

与未改性样品（图5（b））相比，羧基化复合气凝胶（图5（c））表面沉积的磷灰石纳米粒子的晶粒尺寸更小、沉积层更均匀。这是因为羧基化复合气凝胶表面的羧基含量更丰富，电负性更强，可以提供更多的配合位点与 Ca2+络合，从而使磷灰石的成核速率更高，有更多的晶核来诱导HA 生长[22]。该结果与图5（d，e）显示的矿化复合气凝胶的XPS 结果相符。

如图5（d）所示，气凝胶图谱上可识别出碳（C1s）、氧（O1s）、钙（Ca2p）和磷（P2p）的特征峰，这表明有HA沉积在COOH-Cellu/SA-Ca7D 上。COOH-Cellu/SA 气凝胶中n（Ca）∶n（P）=1.35，接近HA 的理论值（1.67）[23]。对比两者的高分辨XPS 谱图（图5（e））的Ca2p 和P2p 特征峰，未改性的矿化复合气凝胶的钙（Ca2p）和磷（P2p）的特征峰强度较弱，难以观察到。COOH-Cellu/SA 气凝胶矿化后的Ca2p 和P2p 特征峰强度明显强于未改性矿化气凝胶的。

2.6 矿化复合气凝胶支架的体外细胞毒性

Live/Dead 染色结果如图6（a，b，c）所示。总的来说，所有实验组的细胞密度相近，细胞结构完整，具有良好的活性，其形态清晰且死细胞较少。在培养24 h 后，细胞正常生长，活细胞被染色成亮绿色，红斑表明出现罕见的死亡细胞。随着时间增加到48 h，细胞增殖导致明显的绿色斑点出现，表明细胞发生了进一步生长与分化。当培养时间延长至72 h 时，矿化后的复合气凝胶和羧基化复合气凝胶浸提液的绿色荧光强度显著提高，表明活细胞的数目更多，细胞生长良好。

图5 Cellu/SA-Ca7D（a，b）、COOH-Cellu/SA-Ca7D（c）的SEM 图片以及其XPS 谱图（d、e）Fig. 5 SEM images of Cellu/SA-Ca7D（a, b）, COOH-Cellu/SA-Ca7D（c）, survey scan （low resolution） of XPS patterns（d） and its high resolution scan（Ca2p and P2p）（e） of COOH-Cellu/SA-Ca7D and Cellu/SA-Ca7D

此外，如图6（d）所示，COOH-Cellu/SA-Ca7D 和Cellu/SA-Ca7D 的L929 细胞活性均在80% 以上。根据ISO 10993-5 中体外细胞毒性评价标准[24]可知，它们的细胞毒性均为1 级，符合无毒标准。这表明它们的体外细胞毒性较低，而且化学改性对其体外细胞毒性影响不大[24]。

图6 L929 细胞加入浸提液培养不同时间Live/Dead 的荧光显微镜图（a，b，c）以及CCK8 毒性测试（d）Fig. 6 Representative Live/Dead fluorescence images of L929 cells cultured with extracts solution （a，b，c） and cell cytotoxicity （d）

3 结 论

（1）采用NaIO4和NaClO2对Cellu/SA 复合气凝胶2 次氧化后，成功将气凝胶表面的羟基氧化为羧基，得到富含羧基的表面活性气凝胶COOH-Cellu/SA。

（2）与未改性复合气凝胶相比，羧基化复合气凝胶表面沉积的磷灰石纳米粒子更多，n（Ca）∶n（P）=1.35。其晶粒尺寸相对较小、沉积层更均匀。

（3）改性前后的复合气凝胶都具有良好的体外细胞毒性，而且化学改性对其体外细胞毒性影响不大。

（4）矿化后的复合气凝胶能够促进细胞增殖，提高细胞活性，是一种理想的骨组织工程材料。