聚醚醚酮/介孔硅酸钙镁复合材料表面周期性微沟槽对细胞行为的影响

韩 航， RAMES Kaewmanee， SYED Asadullah， 沈学宁， 潘泳康， 钱 军， 王雪红， 魏 杰

（华东理工大学超细材料制备与应用教育部重点实验室，上海 200237）

聚醚醚酮（PEEK）是一种特种高分子材料，由于其具有耐高温、自润滑、耐磨损和抗疲劳等优良性能，已成为当今最热门的高性能工程塑料，主要应用于航空航天、汽车工业、食品加工、电子电气和医疗器械等领域[1]。由于具有无毒、质轻、耐腐蚀、生物相容性良好、力学强度高以及弹性模量与骨组织相近等优点，PEEK 作为骨修复材料在临床上（如颅/颌面、脊柱、关节等修复领域）得到了广泛的应用[2,3]。但PEEK 是生物惰性材料，缺乏生物活性，不能与骨组织形成良好的骨整合，容易导致植入体松动，甚至手术失败[4]。因此，对PEEK 进行表面改性，提高其生物活性受到了广泛的关注[5]。

介孔硅酸钙镁（m-MCS）是一种具有纳米孔道的生物活性玻璃，其比表面积大、孔容高[6]。体内外实验研究表明[7,8]：m-MCS 在生理环境中可释放出一定浓度的硅、钙、镁离子，这些离子能够刺激细胞增殖、分化和相关基因表达，以及促进骨组织再生。尽管m-MCS 具有优良的生物相容性和生物活性，但其存在力学强度低、脆性大等缺点。因此，前期研究制备了PEEK/m-MCS 复合材料，使之兼具m-MCS 优良的生物活性和PEEK 优良的力学性能。结果显示：随着m-MCS 含量的增加，复合材料的力学强度和生物活性明显提高，能显著促进成骨细胞黏附、增殖与分化[9,10]。

飞秒激光（FSL）技术是一种应用前景广阔的微纳结构制造技术，能在材料表面高效构建可控的微纳结构，已广泛应用于微光学、微电子学、材料学等领域[11]。FSL 技术具有加工操作简单、尺寸精度高、扫描速率快、加工过程中材料表面氧化程度小等优点，能在多种材料（包括金属、陶瓷、玻璃和高分子）表面制备各种微纳结构（如凹槽、凸起、凹坑等）[12]。利用FSL 技术在材料表面构建微纳图案来调控细胞行为（如黏附、形态、增殖和分化等）是一个很有前景的研究领域[13-15]。因此，本研究采用FSL 技术在PEEK/m-MCS 复合材料表面制备不同宽度的微沟槽，研究其对大鼠间充质干细胞（rBMSCs）响应行为的影响，有关该方面的研究尚鲜见报道。

1 实验部分

1.1 原料和试剂

PEEK：医药级，江门市优巨新材料有限公司；无水乙醇：分析纯，国药集团化学试剂有限公司；牛血清白蛋白（BSA）：w = 98%，上海慧颖生物科技有限公司；十二烷基硫酸钠（SDS）：w = 98%，上海抚生生物科技有限；μBCA 试剂盒：分析纯，Thermo Scientific 公司；磷酸盐缓冲液（PBS）：优级纯，Thermo Scientific 公司；含血清MEM 培养基：w = 10%，Sigma-Aldrich 公司；电镜专用戊二醛固定液：w = 2.5%，NOVON Scientific 公司；CCK-8试剂盒：分析纯，上海翊圣生物科技有限公司；异硫氰酸荧光素标记鬼笔环肽（FITC-phalloidin），4'，6'-二脒基-2-苯基（DAPI）：w ＞ 95%，Sigma-Aldrich 公司；碱性磷酸酶（ALP）检测试剂盒：分析纯, 碧云天生物技术有限公司；SD 大鼠：上海杰思捷动物实验有限公司。

1.2 测试与表征

采用傅里叶变换红外光谱仪（美国Thermo Electron 公司Nicolet 6700 型）分析样品的组成，扫描波数范围为4 000～400 cm-1；采用扫描电子显微镜（日本日立公司S-4800 型）观察样品表面的微观形貌，测试前对样品进行喷金处理；采用激光共聚焦3D 显微镜（日本基恩士公司VK-X110 型）观察样品表面的3D 形貌，采用物镜（20×）扫描样品表面不同位置，通过计算机辅助图像分析材料的表面粗糙度（Ra）；采用酶标仪（中国普朗医疗DNM-9606 型）检测样品表面细胞的吸光度；采用激光共聚焦显微镜（日本尼康公司Nikon AIR 型）观察样品表面的细胞形态。

1.3 复合材料表面的飞秒激光改性

根据先前的研究[10]制备m-MCS 粉末，将PEEK 粉末和m-MCS 粉末按质量比3∶2 混合，然后将混合粉末置于不锈钢模具中，采用压片机制备圆盘形样品（Φ12 mm × 2 mm），随后在马弗炉中烧结4 h（烧结温度为350 ℃），将获得的PEEK/m-MCS 复合材料（PM）表面进行抛光，超声清洗备用。由于rBMSCs 完全铺展后，其尺寸一般在25～40 μm。采用飞秒激光放大器在复合材料表面根据细胞尺寸大小制备微沟槽宽度分别为20 μm（PM20）、40 μm（PM40）和60 μm（PM60）的样品，沟槽深度均为15 μm，飞秒激光加工的参数为：脉冲宽度＜ 200 fs，中心波长为800 nm，重复频率为1 kHz，扫描速率为600～1 000 μm/s。

1.4 蛋白吸附实验

将样品置于24 孔板中，向每孔中添加1 mL 的BSA 溶液（质量浓度为10 mg/mL）。在37 ℃下静置4 h后，用PBS 轻轻洗涤样品3 次，去除松散吸附的蛋白质。然后将样品置于w = 5%的SDS 中，在37 ℃下晃动以释放紧紧吸附的蛋白质。收集含有蛋白质的溶液，用μBCA 试剂盒定量测定蛋白质含量。蛋白质吸附结果以每单位质量样品吸附BSA 的质量表示（mg 蛋白质/g 样品）。

1.5 细胞实验

采用CCK-8 试剂盒，考察rBMSCs 在样品表面的黏附情况。从鼠龄21～28 d，体重70～120 g 的SD 大鼠（雌雄不限）四肢中提取rBMSCs，采用第3～5 代细胞进行体外细胞实验。将样品先用去离子水清洗，再用高压灭菌锅灭菌后置于24 孔培养板中，将rBMSCs（1 mL 溶液中约含2 × 104个细胞）接种到样品表面。将培养板置于37 ℃、体积分数为5%的CO2培养箱中，于6、12 h 和24 h 分别将样品取出放入新的培养板中，每孔中加入400 μL 新鲜培养基和40 μL CCK-8 溶液，空白对照组做相同的处理。在培养箱内孵育4 h，然后从每孔内吸取100 μL 液体转入96 孔板中，做好标记，最后用酶标仪分别在450 nm 和650 nm（参比波长）处测定吸光度（OD）。

采用CCK-8 试剂盒，考察rBMSCs 在样品表面的增殖情况。将细胞在样品上培养1、3 d 和7 d，去除MEM 培养基，用PBS 轻洗3 遍样品表面以除去残余液体，然后用戊二醛固定细胞；在避光条件下，加入FITCphalloidin（每孔200 μL），细胞骨架染色20 min 后用PBS 洗5 遍；接着加入DAPI （每孔200 μL），细胞核染色10 min 后用PBS 洗5 遍；采用激光共聚焦显微镜观察细胞骨架形态及细胞的铺展情况。将细胞在样品上培养1、3 d 和7 d，取出样品置于新培养板中，在CCK-8 溶液中孵育4 h 后用酶标仪分别在450 nm 和650 nm 处测定OD。

通过检测样品表面培养细胞的ALP 活性来评价其成骨分化情况。将细胞接种在样品上，待细胞全部黏附在样品表面后，更换成成骨诱导培养液继续培养，每3 d 更换一次培养液，培养7、10 d 和14 d 后进行ALP活性测定，ALP 活性定义为405 nm 处的吸光度值与总蛋白质质量分数之比。在特定时间点，吸去旧培养基，加入细胞裂解液浸没样品，放入37 ℃恒温震荡箱中孵育90 min。加入μBCA 试剂，以牛血清白蛋白作为标准蛋白质，在波长562 nm 下测定裂解物中的总蛋白质含量。向裂解物中先加入100 μL ALP 工作溶液反应20 min，然后加入100 μL NaOH 溶液（0.1 mol/L）终止反应。使用酶标仪在波长405 nm 下测定吸光度。

1.6 统计学分析

所有实验至少进行3 次，获得的数据均通过OriginPro 8.0（美国，OriginLab Corporation）软件进行处理。数据表示为平均值±标准差（M ± SD），n = 3。 通过单因素方差（ANOVA）分析和Tukey 检验进行统计学分析。当p ＜ 0.05 时，结果具有统计学意义。

2 结果与讨论

2.1 飞秒激光改性复合材料表面的FT-IR 分析

图1 为m-MCS、PEEK、PM 和PM60 的FT-IR谱图。m-MCS 在1 095 cm-1和799 cm-1处出现了Si―O―Si 反对称伸缩振动峰。对于PEEK，1 652 cm-1处的峰归属于C=O 羰基伸缩振动带，1 597 cm-1和1 501 cm-1处为R―O―R 苯环平面内振动峰，1 308 cm-1处为R―CO―R 苯环平面内振动峰，1 226 cm-1处为R―O―R 不 对 称 伸 缩 振 动 峰， 929 cm-1处为R―CO―R 对称伸缩振动峰，1 163 cm-1处为C―H在芳环中的面内弯曲振动峰，840 cm-1和764 cm-1处为 C-H 苯环外弯曲振动峰[16]。对于PM 和PM60，可以观察到m-MCS 和PEEK 的特征峰。这些结果表明：经过飞秒激光改性后，PM60 表面没有出现新的特征峰，其组成结构未发生变化。

2.2 复合材料表面不同宽度微沟槽的3D 形貌及粗糙度

图2（a～c）为 PM20、PM40 和PM60 的激光共聚焦3D 显微镜照片。飞秒激光在复合材料表面形成了周期性的微沟槽，沟槽宽度分别为20、40 μm 和60 μm（沟深均为15 μm）。图2（d）为图2（c）中白色箭头所指区域的粗糙度表征。沟槽脊（Area1）的粗糙度为（1.53 ±0.21） μm，沟槽内表面（Area2）的粗糙度为（5.15 ± 0.35） μm。以上研究表明：复合材料经飞秒激光精确而超快烧蚀后，其表面的PEEK 被气化，形成微沟槽，内表面暴露大量的m-MCS，粗糙度明显增加。当生物材料表面粗糙度在1.12～5.70 μm 时，有利于成骨细胞附着，而且细胞在材料表面的黏附随其粗糙度增加而提高[17]。

图1 m-MCS、PEEK、PM 和PM60 的FT-IR 谱图Fig. 1 FT-IR spectra of m-MCS, PEEK, PM and PM60

图2 PM20（a）、PM40（b）和PM60（c）的激光共聚焦3D 显微镜照片，（d）为（c）中白色箭头所指区域的粗糙度（*代表p ＜ 0.05）Fig. 2 Laser confocal 3D micrographs of PM20（a）, PM40（b） and PM60（c）；（d）Surface roughness of the area indicated by the white arrow in （c） （* Represents p ＜ 0.05）

2.3 复合材料表面不同宽度微沟槽的微观形貌

图3 （a～d）为 PM20、PM40 和PM60 的SEM 照片。飞秒激光在复合材料表面构建了宽度为20、40 μm和60 μm 的微沟槽，且不同宽度微沟槽的内表面均为微纳结构，没有明显区别。从图3（d）中可以看出，PM60微沟槽内表面为微米丝状结构，这是由于表面PEEK 被激光烧蚀，暴露出大量含有纳米孔的m-MCS 颗粒。

图3 PM20（a）、PM40（b）和PM60（c, d）表面微观形貌的SEM 照片Fig. 3 SEM images of PM20（a）, PM40（b） and PM60（c, d）

2.4 微沟槽宽度对蛋白吸附及细胞黏附的影响

图4 （a）为样品对牛血清白蛋白的吸附性。PM、PM20、PM40 和PM60 对蛋白质的吸附量分别为（0.29 ±0.10），（0.83 ± 0.08），（1.42 ± 0.09） mg/g 和（1.73 ± 0.08） mg/g。随着微沟槽宽度的增加，蛋白质的吸附量增加。图4（b）为rBMSCs 在样品表面培养不同时间后的黏附情况。培养6 h，细胞在PM20 和PM40 表面的黏附量没有显著性差异；培养12、24 h，细胞在PM40 表面的黏附量显著高于PM20 和PM；在所有的时间点，PM60表面细胞的黏附量最高。

图4 （a）样品在BSA 溶液中浸泡24 h 后的蛋白吸附量；（b）rBMSCs 在样品表面培养不同时间的细胞黏附情况Fig. 4 （a） BSA protein adsorption on samples after soaking in BSA solution for 24 h; （b） rBMSCs adhesion on the samples after cultivated for different time

这是由于随着沟槽宽度增加，暴露的m-MCS 颗粒增多，具有微纳结构和高粗糙度的内表面积就增大，复合材料表面的亲水性（m-MCS 具有高亲水性）就增高[9]，这些表面特征有利于蛋白质吸附，而蛋白质吸附有利于细胞的早期黏附[17-20]。另外，微纳结构能够为细胞提供更多的结合位点，在纳米尺度上与细胞伪足相互作用，从而提高细胞的黏附性[21]。

2.5 微沟槽宽度对细胞生长行为的影响

图5 rBMSCs 在PM、PM20、PM40 和PM60 表面培养后的细胞形态的激光共聚焦照片Fig. 5 Laser confocal photographs of the cell morphology of rBMSCs cultivated on the surface of PM, PM20, PM40 and PM60

图5为rBMSCs 在样品表面培养1 d（图5（a））、3 d（图5（b））和7 d（图5（c））的激光共聚焦照片。从图5（a）可以看出：细胞在PM 表面比较散乱；在PM20 表面，细胞也没有明显的生长取向；少量细胞在PM40 表面沿着沟槽生长，部分细胞黏附在沟槽脊上；大部分细胞在PM60 表面沿着沟槽定向生长，部分细胞有丝状伪足伸出。由于微沟槽的内表面具有微纳结构，并暴露大量的m-MCS 颗粒，其粗糙度和亲水性明显高于沟槽脊[9]，因此，细胞倾向沿着沟槽内表面黏附和生长。当沟槽尺寸小于细胞尺寸时，不利于细胞沿着沟槽黏附和长入；当沟槽宽度为40 μm 时，沟槽的尺寸与细胞的尺寸相近，细胞倾向沿着沟槽生长；当沟槽宽度为60 μm 时，沟槽的尺寸略微大于细胞的尺寸，更加有利于细胞沿着沟槽定向生长。

从图5（b）可以看出：细胞在PM 表面随机生长；在PM20 表面，细胞没有明显的生长取向，也没有明显铺展；在PM40 表面细胞沿着沟槽生长，并明显铺展，显示细长条状形貌；在PM60 表面细胞沿着沟槽生长，铺展更好，多个细胞叠在一起定向生长。从图5（c）可知：细胞培养7 d 后，大量细胞在PM40 和PM60 表面沿着沟槽定向生长。

2.6 微沟槽宽度对细胞增殖及分化的影响

图6（a）为rBMSCs 在样品表面培养不同时间的细胞增殖情况。结果显示：在1、3 d 和7 d，与其他对照组相比，细胞在PM表面的吸光度都最低，表明细胞增殖最差；而细胞在PM60 表面的吸光度都最高，表明细胞增殖最好。图6（b）为rBMSCs 在样品表面培养不同时间的ALP 活性表达情况。ALP 通常被认为是细胞成骨分化的标志物[22]。结果显示：在7、10 d 和14 d，与其他对照组相比，细胞在PM 表面的ALP 活性都最低，表明细胞成骨分化最低；而细胞在PM60 表面的ALP 活性都最高，表明细胞成骨分化最好。上述结果表明：微沟槽宽度越宽，越有利于细胞沿着沟槽增殖和成骨分化。

图6 rBMSCs 在样品表面培养不同时间后的细胞增殖情况（a）和ALP 活性（b）Fig. 6 Cell proliferation （a） and ALP activity （b） after rBMSCs cultivated on the surface of samples for different time

3 结 论

采用飞秒激光技术在PEEK/m-MCS 复合材料表面构建了不同宽度（20、40 μm 和60 μm）的周期性微沟槽，其内表面形成了微纳结构，暴露出大量的m-MCS 颗粒，表面粗糙度增加。随着微沟槽宽度的增加，蛋白质吸附量提高。微沟槽宽度明显影响rBMSCs 的响应行为，当微沟槽宽度为60 μm 时，复合材料表面显著地促进了细胞黏附、增殖与分化，并且诱导细胞沿着沟槽方向生长。