UPLC法同时测定佛手散水煎剂中4种药效成分含量

贾智若，陈明伟，李文秀，陈美安，甄汉深

（广西中医药大学，广西 南宁 530200）

佛手散，又名芎汤，出自《普济本事方》卷十，由当归、川芎药对等比例配伍组方，是养血活血、行气散瘀的中医经典方剂，近年临床上多用于脑中风、脑动脉硬化症、深静脉血栓等心脑血管疾病的治疗，疗效确切［1-5］。

本课题组前期对佛手散水煎剂的化学成分进行了分析，研究发现佛手散水煎剂成分较为复杂，主要由有机酚酸类和苯酞类成分组成。其中酚酸类代表成分阿魏酸具有抑制血小板聚集、抗血栓、抗氧化等作用，而苯酞类代表成分洋川芎内酯Ⅰ、洋川芎内酯A和藁本内酯被证实是对心脑血管起保护作用的主要成分，这4种有效成分的药效与佛手散的药理作用相吻合［5-7］。目前关于佛手散水煎剂有效成分含量测定已有一些报道，多见于对其中单个有效成分的含量测定［8-10］，多种活性成分同时测定的方法鲜有报道，也未见采用超高效液相色谱法（UPLC）测定的报道。本试验建立UPLC法同时测定佛手散水煎剂中阿魏酸、洋川芎内酯Ⅰ、洋川芎内酯A和藁本内酯的含量测定方法，以期为该方汤剂的质量控制提供方法和依据。

1 实验材料

1.1 仪器 Agilent 1290超高效液相色谱仪（美国Agilent公司）；FD-5N冷冻干燥机（日本Eyela株式会社）；BP211D电子分析天平（德国Sartorius公司）；LG16-W型离心机（北京医用离心机厂）；HKD-100超纯水机（深圳Pnike公司）。

1.2 试药与试剂 当归Angelica sinensis（Oliv.）Diels（批号20130401）、川芎Ligusticum chunxiong Hort.（批号20130215）饮片购自广东紫云轩药业有限公司，经广西中医药大学药用植物教研室梁子宁教授鉴定符合药典要求；阿魏酸对照品（购自中国药品生物制品检定所，批号：110773-201313）；藁本内酯对照品（中国药品生物制品检定所，批号：111737-201305）；洋川芎内酯A（深圳伽马科技有限公司，含量为98%，批号：20130301）；洋川芎内酯Ⅰ（深圳伽马科技有限公司，含量为98%，批号：20130405）；甲醇为色谱纯，水为超纯水，其余试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 UPLC液相色谱条件 Eclipse plus C18色谱柱（2.1 mm×100 mm，1.8 μm）；流动相A相为甲醇，B相为0.2%醋酸水溶液，进行梯度洗脱：0～5 min，A相保持5%；5～20 min，A 相从5%线性改变至20%；20～40 min，A相从20%线性改变至40%；40～65 min，A相从40%改变至80%；流速：0.2 ml/min；检测波长：280 nm；进样量：5 μl；柱温：30℃。对照品及供试品溶液色谱图见图1。

图1 UPLC色谱图

2.2 佛手散水煎剂的制备 按处方比例（1∶1）精密称取当归、川芎粗粉各30g，加10倍量水浸泡30min，煎煮3次，每次60 min，滤过，合并3次滤液，减压浓缩后得生药含量为0.2g/ml的佛手散水煎剂，经冷冻干燥制成粉末，备用。

2.3 混合对照品溶液的制备 精密称取阿魏酸、洋川芎内酯Ⅰ、洋川芎内酯A、藁本内酯对照品各适量，分别置于棕色量瓶中，加甲醇配制成含阿魏酸1.88 mg/ml、洋川芎内酯Ⅰ0.92 mg/ml、洋川芎内酯A 1.22 mg/ml、藁本内酯0.68 mg/ml的对照品贮备溶液。

2.4 供试品溶液的制备 精密称取佛手散冻干粉0.501 1 g，置于5 ml棕色量瓶中，加去离子水溶解，定容至刻度，摇匀，静置，取上清液，用0.22 μm滤膜滤过，取续滤液，即得。

2.5 线性关系的考察 精密吸取2.3项下各对照品贮备液适量，置于同一10 ml棕色量瓶中，用甲醇溶解定容至刻度，配制成阿魏酸、洋川芎内酯Ⅰ、洋川芎内酯A和藁本内酯浓度依次为382.9μg/ml、371.1μg/ml、97.21 μg/ml、27.62 μg/ml的混合对照品溶液，并逐级稀释成不同质量浓度的系列对照品溶液，按照2.1项下色谱条件进样5 μl测定。以峰面积（Y）为纵坐标，浓度X（μg/ml）为横坐标，绘制标准曲线，计算各自的回归方程和线性范围，结果见表1。4个化合物在各自线性范围内呈良好的线性关系，灵敏度较高。

表1 标准曲线回归方程及线性范围

2.6 精密度试验 取同一批佛手散水煎剂样品，于1 d内连续重复进样6次，连续3 d分别进样分析，记录阿魏酸、洋川芎内酯Ⅰ、洋川芎内酯A、藁本内酯的峰面积值，计算4种成分的日内精密度（n=6）和日间精密度（n=3），结果显示阿魏酸的日内精密度RSD为0.79%，日间精密度RSD为1.08%；洋川芎内酯Ⅰ的日内精密度RSD为1.01%，日间精密度RSD为1.49%；洋川芎内酯A的日内精密度RSD为0.94%，日间精密度RSD为1.35%；藁本内酯的日内精密度RSD为1.15%，日间精密度RSD为2.05%。

2.7 稳定性试验 取同一份佛手散供试品溶液，按2.1项下色谱条件，分别在0 h、2 h、4 h、6 h、8 h、12 h进样5 μl，分别测定各指标成分的峰面积。在12 h内阿魏酸的平均含量为0.971 1 mg/g，RSD为0.92%（n=6）；洋川芎内酯Ⅰ的平均含量为0.737 9 mg/g，RSD为1.56%（n=6）；洋川芎内酯A的平均含量为0.226 0 mg/g，RSD为1.93%（n=6）；藁本内酯的平均含量为0.067 9 mg/g，RSD为1.71%（n=6），表明样品至少在12 h内稳定。

2.8 重复性试验 取同一批佛手散样品，按2.4项下方法平行制备6份供试品溶液，按2.1项下色谱条件进样5 μl测定。阿魏酸的平均含量为1.033 5 mg/g，RSD为0.46%（n=6）；洋川芎内酯Ⅰ的平均含量为0.816 6 mg/g，RSD为1.81%（n=6）；洋川芎内酯A的平均含量为0.287 8 mg/g，RSD为1.55%（n=6）；藁本内酯的平均含量为0.071 6 mg/g，RSD为1.78%（n=6）。

2.9 加样回收率试验 取同一批已知含量的佛手散样品粉末（过三号筛）6份，每份约0.25 g，精密称定，置半微量圆底烧瓶中，分别准确加入低、中、高3个浓度各2份的对照品贮备液适量，加水2.5 ml回流煎煮3次，每次60 min，滤过，滤渣洗涤2次，合并滤液，浓缩定容至5 ml，摇匀，静置，取上清液滤过，取续滤液，即得。按2.1项下色谱条件分别进样5μl测定分析，计算回收率，结果见表2。

表2 加样回收率试验结果 （n=6）

2.10 样品测定 分别称取3批佛手散冻干粉样品，按2.4供试品溶液制备项下方法制备，吸取5 μl供试品溶液进样分析，按外标一点法计算佛手散煎剂中阿魏酸、洋川芎内酯Ⅰ、洋川芎内酯A以及藁本内酯的含量，结果见表3。

表3 佛手散煎剂中4种药效成分含量测定结果（n=3）

3 讨 论

本研究为使各成分获得最大灵敏度和分离度，同时又简化操作，先采用DAD检测器对阿魏酸、洋川芎内酯Ⅰ、洋川芎内脂A、藁本内脂此4种药效成分进行全波长扫描，再根据各成分最大吸收波长与含量的多少，最终确定各成分检测波长为280 nm。鉴于佛手散水煎剂成分复杂，采用常规的等度洗脱条件难以实现对此4种成分的有效分离，为此，实验过程中又分别选取不同的流动相系统及梯度洗脱条件对样品进行试验，结果以甲醇-0.2%醋酸水溶液为流动相进行梯度洗脱基线平稳，各色谱峰分离度佳。

中药复方成分复杂，仅以其中单一成分为指标的质量控制方法显然有失偏颇，由单一成分定量向多指标、多成分定量是中药质量评价的发展方向。目前佛手散水煎剂以及单味药当归和川芎水煎剂的含量测定均有报道，多以单个阿魏酸或川芎嗪为指标进行含量测定［8-10］。本试验建立了UPLC法在同一色谱条件下同时测定佛手散水煎剂中4种药效成分的方法，不同批次样品含量测定结果表明，建立的方法具有良好的重现性与适用性，可较全面地评价佛手散水煎剂的质量，可为佛手散水煎剂及其相关制剂的质量控制提供科学依据。