妇安消疹洗液对小鼠迟发型变态反应的影响

何秀丽，景海霞，李 炯，刘文韬，杜 晓，常明泉

（1.十堰市太和医院，湖北 十堰 442000；2.湖北医药学院，湖北 十堰 442000）

妇安消疹洗液是十堰市太和医院制剂（批准文号：鄂药制字Z20180417，规格：每瓶250 ml，生药含量0.672 g/ml），该药物具有清热解毒、祛风除湿、杀虫止痒、收敛的作用，用于湿疹、丘疹性荨麻疹、皮肤瘙痒、体股癣、汗疱疹、接触性皮炎等治疗，在妇科主要用于妇科腔道炎症冲洗等［1］。近年来，该洗液在临床上的用途得到扩展，广受患者欢迎，而其药理机制研究尚属空白，为进一步明确其药理作用，为临床合理用药、安全用药提供理论依据，笔者拟建立小鼠实验动物模型，对其抗Ⅳ变态反应的药理作用进行实验研究。

1 材料与方法

1.1 药物与试剂 二硝基氯苯（DNCB，武汉江岸化试有限公司提供，规格：100 g，含量98.0%，批号：20161206）；4-氨基吡啶（4-AP，阿尔法公司生产，规格:100 g，含量94.1%，批号:20170411）；磷酸组织胺（上海哈灵生物科技有限公司提供，规格：250 mg，含量99.0%，批号:20161513）；0.9%氯化钠溶液（四川科伦药业股份有限公司生产，规格：250 ml，批号:L118060801）；地奈德乳膏（重庆华邦制药有限公司生产，批号：20180319）；标准妇安消疹洗液（十堰市太和医院制剂室生产，含生药0.672 g/ml，批号：201801116）；高剂量妇安消疹洗液（取标准妇安消疹洗液500 ml，用旋转蒸发仪浓缩至250 ml，含生药1.344 g/ml，临时配制）；中剂量妇安消疹洗液（取标准妇安消疹洗液250 ml，含生药0.672 g/ml，临时配制）；低剂量妇安消疹洗液（取标准妇安消疹洗液加纯化水按1∶1比例稀释，含生药0.336 g/ml，临时配制）。

1.2 实验动物 C57BL/6/ICR小鼠，体质量（20±2）g，周龄6，由湖北医药学院动物实验中心提供，实验动物生产许可证号：SCXK（鄂）2016-0008；实验动物使用许可证号：SYXK（鄂）2016-0031；饲养条件：恒温、恒湿，每天给予固体饲料和足量维生素，自由饮水。

1.3 实验数据处理 实验数据应用SPSS 13.0软件处理，各组实验结果以均数±标准差（±s）表示；多组间实验结果的分析应用方差法，成对组间结果分析应用LSD-t检验法。

1.4 妇安消疹洗液对Ⅳ型变态反应的抑制作用 取健康小鼠72只，随机将其分为6组，各组12只，雌雄各半，分组情况为:妇安消疹洗液高剂量组、妇安消疹洗液中剂量组、妇安消疹洗液低剂量组、地奈德组、模型组、空白组。将每组小鼠腹部、两耳廓剃毛，左耳廓外搽给药，右耳做对照。空白组、模型组每只小鼠给予0.9%氯化钠溶液0.1 ml/cm2，地奈德组每只小鼠给予地奈德乳膏0.05 g/cm2，妇安消疹洗液高、中、低剂量组分别给予相应浓度的妇安消疹洗液0.1 ml/cm2；每天1次，持续给药7 d。除空白组外，其他5组小鼠在第1次给药24 h后，在腹部和左耳廓剃毛处给予5%DNCB丙酮溶液0.05 ml涂抹致敏，第2天再给予5%DNCB丙酮溶液0.05 ml增强，第3、4、5天不给药，第6天再给予5%DNCB丙酮溶液0.05 ml，给药1 h后在小鼠左耳廓内外两面都均匀涂抹5%DNCB丙酮溶液，剂量为20 μl，施行激敏攻击，激敏攻击1 h后处死小鼠，左右耳对应部位分别用直径6 mm的打孔器打取相同面积的耳片，用分析天平称取双耳片重量，计算耳肿胀度［耳肿胀度 =左耳重量（mg）－右耳重量（mg）］；依法摘取小鼠胸腺，用分析天平称重，计算胸腺指数［胸腺指数 = 胸腺重量（mg）/体重（g）×10］；依法摘取小鼠脾脏，用分析天平称重，计算脾脏指数［脾脏指数=脾脏重量（mg）/体重（g）×10］。

1.5 妇安消疹洗液对4-AP致痒反应的抑制作用 取健康小鼠72只，随机将其分为6组，各组12只，雌雄各半，分组情况为:妇安消疹洗液高剂量组、妇安消疹洗液中剂量组、妇安消疹洗液低剂量组、地奈德组、模型组、空白组。实验前24 h，将小鼠背部剃毛约2 cm×2 cm，谨慎操作，避免伤及皮肤，剃毛完毕后查看每只小鼠剃毛区域是否有皮肤破损，将剃毛区皮肤有损伤的小鼠淘汰［2-3］。空白组、模型组小鼠均给予0.9%氯化钠溶液0.1 ml/cm2，地奈德组给予地奈德乳膏0.05 g/cm2，妇安消疹洗液的高、中、低剂量组小鼠分别给予相应浓度的妇安消疹洗液0.1 ml/cm2；每日1次，持续给药7 d。于末次给药30 min后，妇安消疹洗液高剂量组、妇安消疹洗液中剂量组、妇安消疹洗液低剂量组、地奈德组、模型组每只小鼠在背部剃毛处皮下注射4-AP（注射剂量按1 mg/kg计算），空白组在背部剃毛处注射相同剂量的0.9%氯化钠溶液。给药结束后观察各组动物在10 min内的反应，小鼠连续舔体直至短暂停顿时记录为1次舔体。

1.6 妇安消疹洗液对磷酸组织胺致痒阈的影响 取健康小鼠50只，将其随机分成5组，每组10只，雌雄各半，即妇安消疹洗液高剂量组、妇安消疹洗液中剂量组、妇安消疹洗液低剂量组、地奈德组、模型组。实验前24 h，将各组小鼠左后足背剃毛，妇安消疹洗液的高、中、低剂量组小鼠分别给予相应浓度的妇安消疹洗液0.1ml/cm2；模型组给予0.9%氯化钠溶液0.1ml/cm2；地奈德组给予地奈德乳膏0.05 g/cm2。实验时，取零号砂纸磨擦实验小鼠左后足剃毛部位，磨擦面积约1 cm2，磨擦程度以表皮有轻度出血、轻度损伤为度，备皮成功，每只实验小鼠在皮损部位滴加浓度为0.01%的磷酸组织胺溶液0.05 ml，随后每5分钟追加磷酸组织胺溶液 1次（0.05 ml），浓度依次按 0.01%、0.02%、0.03%……0.1%递增，实验时注意观察动物表现，待小鼠扭头舔左后足时停止给药，所用磷酸组织胺溶液的总剂量即为致痒阈。

2 结果

2.1 妇安消疹洗液对Ⅳ型变态反应的抑制结果 试验结果显示，5%DNCB丙酮溶液可引起模型组小鼠耳肿胀度、胸腺、脾脏指数显著增加，与空白组比较有显著性差异（P＜0.05）；妇安消疹洗液各剂量均能不同程度抑制5%DNCB丙酮溶液引起的小鼠Ⅳ型变态反应，而中、高剂量组对小鼠耳肿胀度、胸腺指数、脾脏指数抑制效果与模型组比较均具有统计学意义（P＜0.05）；妇安消疹洗液局部外用可抑制5%DNCB丙酮溶液诱发的小鼠Ⅳ型变态反应，且存在一定的量效关系。结果见表1。

表1 各组对DNCB所致小鼠Ⅳ型变态反应的抑制作用 （±s）

表1 各组对DNCB所致小鼠Ⅳ型变态反应的抑制作用 （±s）

注：与空白组比较，①P＜0.05；与模型组比较，②P＜0.05

组 别空白组模型组地奈德组妇安消疹洗液低剂量组妇安消疹洗液中剂量组妇安消疹洗液高剂量组n 给药剂量12 12 12 12— —0.05 g/cm2 0.1 ml/cm2耳肿胀度（mg）0.7±0.3 23.1±5.4①12.5±2.2②19.6±3.3胸腺指数（mg/g）1.197±0.281 2.399±0.525①1.286±0.435②1.941±0.317脾脏指数（mg/g）1.542±0.587 3.723±0.486①2.198±0.215②3.574±0.276 120.1 ml/cm214.9±2.6②1.657±0.391②2.731±0.312②120.1 ml/cm212.7±2.4②1.356±0.523②2.128±0.333②

2.2 妇安消疹洗液对4-AP致痒反应结果 注射4-AP后，与空白组比较，模型组小鼠舔体反应次数显著增多（P＜0.05）；从舔体次数比较，妇安消疹洗液低、中、高剂量组对4-AP的止痒效果具有一定的量效关系，与模型组比较具有统计学意义（P＜0.05），表明妇安消疹洗液低、中、高剂量均能显著抑制4-AP诱发的瘙痒反应。结果见表2。

表2 各组由4-AP诱发舔体反应的次数（±s）

表2 各组由4-AP诱发舔体反应的次数（±s）

注:与空白组比较，①P＜0.05；与模型组比较，②P＜0.05

组 别空白组模型组地奈德组妇安消疹洗液低剂量组妇安消疹洗液中剂量组妇安消疹洗液高剂量组n 给药剂量12 12 12 12——0.05 g/cm2 0.1 ml/cm2舔体反应次数（次/10 min）6.1±2.6 33.9±8.4①21.8±7.1②25.5±10.3②120.1 ml/cm223.2±9.7②120.1 ml/cm221.5±6.1②

2.3 妇安消疹洗液对磷酸组织胺致痒阈影响结果 妇安消疹洗液各剂量组、地奈德组的磷酸组织胺致痒阈显著高于模型组（P＜0.05），妇安消疹洗液低、中、高剂量对小鼠磷酸组织胺致痒阈的提升效应依次升高，存在量效关系。妇安消疹洗液中剂量组致痒阈与地奈德组接近，高剂量组显著高于地奈德组（P＜0.05）。结果见表3。

表3 各组小鼠磷酸组织胺致痒阈测定的结果（±s）

表3 各组小鼠磷酸组织胺致痒阈测定的结果（±s）

注:与模型组比较，①P＜0.05；与地奈德组比较，②P＜0.05

组 别n 给药剂量 致痒阈（μg）模型组地奈德组妇安消疹洗液低剂量组妇安消疹洗液中剂量组妇安消疹洗液高剂量组10 10 10—0.05 g/cm2 0.1 ml/cm2 85.2±26.2 306.9±44.2①180.6±33.7①100.1 ml/cm2298.6±41.4①100.1 ml/cm2364.9±69.5①②

3 讨论

Ⅳ型变态反应是由特异性致敏效应T细胞介导的细胞免疫应答的一种类型，T淋巴细胞产生大量IL-2反作用于中枢免疫器官，胸腺内的T淋巴细胞诱导早期T淋巴细胞向CD8+单阳性细胞转化，使凋亡的双阳性细胞减少，进而使胸腺增重，胸腺指数变大；大量初始T淋巴细胞同时识别特异性变应原及免疫相关分子发生活化效应，产生包括IL-2在内的多种淋巴因子，刺激CD4+T淋巴大量增殖，造成相应的脾脏重量增加，脾脏指数变大；在小鼠体中，绝大多数蛋白质抗原的Ⅳ型超敏反应均可经CD4+T细胞被动转移；皮肤源性瘙痒是由组胺敏感性的无髓C类神经纤维进行传导的，在湿疹、特异性皮炎等皮肤疾病的病理过程中，Ⅳ型变态反应所释放的炎症介质也与皮肤瘙痒的产生有密切的关系［4-6］。

研究发现，妇安消疹洗液对DNCB诱导的小鼠耳肿胀、胸腺肿胀、脾肿胀具有显著的抑制作用，并能显著抑制4-AP诱导的瘙痒反应、提升磷酸组织胺致痒阈，这与妇安消疹洗液组方药物所含活性成分有关。妇安消疹洗液是以野菊花、苦参、漏芦、土茯苓、蛇床子、白矾6味中药组方，经过水煎提取、过滤、沉淀、离心、浓缩、灭菌等工艺制备而得的一种中药复方外用洗液。野菊花素有中药“广谱抗生素”之称，所含糖苷、黄酮、萜类具有抗炎、抗病毒作用，对金葡菌、绿脓杆菌等抑菌力强［7］，用于消除小鼠变态反应皮损处炎症；苦参碱［8］、蛇床子素［9］具有抗组胺样作用，杀虫止痒、抗过敏，对DNCB诱导的小鼠变态反应、瘙痒能产生较强的抑制作用；蛇床子中的花椒毒酚［10］具有一定的镇痛与表面麻醉效果，对4-AP诱发的小鼠瘙痒反应与炎症因子能产生良好的抑制作用，可能通过抑制N-型钙通道，阻滞小鼠神经传导、钝化皮下外周神经对瘙痒的反应，从而提升磷酸组织胺致痒阈；白矾具有较强的蛋白凝固作用，低浓度有收敛、消炎、防腐作用，其溶液通过进入小鼠皮下组织细胞，抑制、延迟细胞介导反应，降低免疫球蛋白与细胞表面受体的结合，抑制白介素的合成与释放，促进Th1/Th2的平衡，产生免疫抑制作用，从而改善外周免疫状态［11］；土茯苓中的落新妇苷、漏芦中的噻吩类、萜类物质具有抗菌消痈，改善外周微循环的功效，通过抑制组胺、毒性物质的释放减轻DNCB诱导小鼠的耳肿胀、胸腺肿胀、脾肿胀等变态反应［12-13］。实验中所用对照药物地奈德乳膏属于糖皮质激素乳膏，对接触性皮炎、脂溢性皮炎、神经性皮炎、银屑病具有良好的治疗作用［14］。

妇安消疹洗液具有抗Ⅳ型变态反应、止痒、提升磷酸组织胺对小鼠致痒阈的作用，该制剂在临床可用于具有Ⅳ型变态反应特征的皮损治疗。随着药理作用的明确其用途越来越宽泛，不仅在成人、而且在儿童群体中陆续也有些应用，尽管在临床应用方面疗效得到肯定，但其药理机制、适宜性需要得到进一步验证和甄别，在不同年龄人群的用量用法需要通过多角度的药理研究提供科学依据。通过妇安消疹洗液对小鼠抗Ⅳ型变态反应的实验研究可填补该制剂药理及基础研究的部分空白，为该制剂在临床中的合理、科学、安全用药提供依据。