高效液相色谱-串联质谱法同时测定小麦粉中28种真菌毒素

杨 帅 穆 蕾 杨悠悠 孙小杰 史晓媛 罗云敬 杨永坛

(北京工业大学1，北京 100124)

(中粮营养健康研究院；营养健康与食品安全北京市重点实验室2，北京 102209)

(SCIEX中国应用支持中心3，北京 100015)

真菌毒素又名霉菌毒素，是一种由真菌在一定条件下产生的小分子次生代谢产物[1]。目前，人们已知的真菌毒素有400多种，其中大多数都有着致癌、致畸、致突变的“三致”作用，对人体及动物的健康危害极大，被世界卫生组织(WHO)和联合国粮农组织(FAO)列为食源性疾病的3大根源，而我国真菌毒素污染情况不容乐观[2]。

在实际生产生活中，加工、储存不当都有可能引起粮食作物、市售食品、饲料等发生霉变，造成真菌毒素污染[3，4]。根据调查显示，引起我国小麦真菌毒素污染的主要是镰刀菌毒素，其中脱氧雪腐镰刀菌烯醇(DON)的检出率在55%～100%；玉米赤霉烯酮(ZEN)的检出率在5.9%～100%，超标率达到38.6%[5]。为保障食品的质量和安全性，国内外纷纷制定了相关的法律法规，针对不同的食品基质限制其中可能出现的真菌毒素种类及含量。我国GB 2761—2017针对小麦粉基质中的黄曲霉毒素B1(AFTB1)、脱氧雪腐镰刀菌烯醇、赭曲霉毒素A(OTA)、玉米赤霉烯酮进行了含量限定要求[6]。然而毒素目标物覆盖的种类仍不够全面；其次各国和地区的法规也忽视了毒素衍生物的潜在危害等问题。

目前，小麦粉基质中的真菌毒素残留主要集中在黄曲霉毒素、玉米赤霉烯酮、呕吐毒素、伏马毒素等几大类[7]。检测方法主要有液相色谱法[8-10]、液相色谱串联质谱法(LC-MS/MS)[11-15]以及酶联免疫法等[16，17]。样品前处理方法则主要采用免疫亲和柱净化。该前处理方法的优势在于利用抗原抗体专一结合进行样品净化，选择性强，能够专一地捕获提取液中的目标物，保证净化效果以规避基质复杂及易受干扰等问题。但同时也造成了方法应用面狭窄，检测成本昂贵的问题，不适用于一次性多类毒素筛查。因此，本研究尝试通过提取试剂的优化，开发适合小麦粉基质中多类毒素的样品前处理方法，并建立28种真菌毒素的快速筛查方法。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

甲醇；乙腈(色谱纯)；甲酸(色谱纯)；甲酸(98%)；超纯水；黄曲霉毒素混合标准溶液(AFTB1、AFTB2、AFTG1和AFTG2);黄曲霉毒素M1、M2标准溶液(AFTM1、AFTM2); T-2毒素标准溶液(T-2)；HT-2毒素标准溶液(HT-2)；赭曲霉毒素A、B标准溶液(OTA、OTB)；伏马毒素B1、B2、B3标准溶液(FB1、FB2、FB3)；呕吐毒素混合标准溶液(DON、3-Ac-DON、15-Ac-DON、Niv)；3-葡萄糖苷化-脱氧雪腐镰刀菌烯醇标准溶液(DON-3-Glu)；渥曼青霉素标准溶液(Wor)；新茄病镰刀菌烯醇标准溶液(Neo)；蛇形毒素标准溶液(Dia)；杂色曲霉素标准溶液(Ster)；玉米赤霉烯酮标准溶液(ZEN)；α、β-玉米赤霉烯醇标准溶液(α-ZEL、β-ZEL)；玉米赤霉酮标准溶液(ZAN)；α、β-玉米赤霉醇标准溶液(α-ZAL、β-ZEL) 。

1.2 仪器与设备

LC-30AD高效液相色谱仪；QTRAP 5500 三重四级杆质谱仪；Allegra 64R台式高速离心机；TTL-DCⅡ型氮吹仪；Mili Q超纯水机；Dragon Lab QL902涡旋振荡器；SB-3200DTDN 超声波清洗器。

1.3 样品前处理

准确称取2.5 g小麦粉样品(精确至0.01 g)于50 mL离心管中，加标样品根据需要加入标准溶液；加入10 mL提取液(乙腈/水/甲酸，80∶18∶2，涡旋振荡1 min，超声提取20 min，8 000 r/min 离心10 min，取4 mL上清液转移至一洁净试管，在40 ℃水浴下，氮气吹干，最后加入1 mL复溶液(甲醇/水/甲酸，30∶70∶0.1)复溶，涡旋震荡30 s，超声溶解5 min，12 000 r/min离心10 min，取上层清液于样品瓶中待测。

1.4 仪器条件

1.4.1 色谱条件

色谱柱：Shiseido-C18(100 mm×2.0 mm，3 μm)，进样量20 μL，流速0.3 mL/min；流动相：A相为0.1%甲酸/水溶液，B相为0.1%甲酸/甲醇溶液，正负离子模式洗脱梯度如表1所示。

表1 梯度洗脱程序

1.4.2 质谱条件

电喷雾离子源(ESI)，离子源温度：550 ℃；离子喷雾电压：5 500 V(正模式)/-4 500 V(负模式)；气帘气：35 psi；气体1：50 psi；气体2：55 psi；采用多反应监测(MRM)模式进行检测。质谱参数见表2。

表2 质谱条件参数

2 结果与分析

2.1 真菌毒素的分离优化

由于28种真菌毒素目标物的结构性质差异较大，为实现检测灵敏度最优，部分目标物需在正模式下离子化，而另一部分需要在负模式下离子化，故需要将毒素目标物分组，对样品进行正负模式下的两次测定。流动相选用甲醇/水体系，向溶剂中加入适当甲酸可以促进毒素目标物在正离子监测模式下的电离，可改善峰型和灵敏度。经优化后，28种真菌毒素混合标准溶液的MRM色谱图如图1和图2所示。

图1 18种真菌毒素混标的正模式MRM色谱图

图2 10种真菌毒素混标的负模式MRM色谱图

2.2 前处理方法优化

本研究使用乙腈/水/甲酸体系对真菌毒素进行提取，并对乙腈的比例进行了优化，如图3所示。由于伏马毒素的支链上通常会含有多个羧基，亲水性较强，使用高有机相体系则会导致其回收率部分损失，故我国国家标准及目前其他伏马毒素检测方法中主要使用使用水含量较高的提取溶剂进行提取[18，19]。但本实验中，应用乙腈/水/甲酸(50∶48∶2)进行提取时，提取液中高比例的水会大量溶出基质中的杂质，造成方法灵敏度降低；其次，部分毒素的回收率也会显著下降，以黄曲霉毒素B1为例，回收率会下降至60%以下。经过优化，使用乙腈/水/甲酸(80∶18∶2)提取液时，非极性较大的部分毒素如黄曲霉毒素、镰刀菌属毒素、赭曲霉毒素等均有较好的提取效率，同时，伏马毒素的回收率仍维持在60%以上。综合考虑，选取乙腈/水/甲酸(80∶18∶2)作为提取液，可以满足对28种毒素目标物进行统一前处理并保证各目标物的回收率的要求，回收率范围为60%～110%。

图3 两种提取溶剂对于毒素目标物回收率的影响

2.3 方法学验证

2.3.1 方法的线性关系；检出限；定量限

取空白小麦粉基质，按照优化后的前处理方法进行处理，得到空白基质提取液。标准工作液使用空白基质提取液配制，按照1.4中的条件进行测定。以各毒素目标物的质量浓度(x)为横坐标，定量离子峰面积(y)为纵坐标，绘制工作曲线。以3倍信噪比和10倍信噪比时对应的目标物峰面积计算浓度，确定方法对于各目标物的检出限(LOD)和定量限(LOQ)，结果如表3所示。28种真菌毒素目标物在其各自的线性范围内线性关系良好，相关系数(R2)大于0.997，定量限均低于我国规定的粮食中真菌毒素限量标准，能够满足日常检测的需求。

表3 线性方程；检出限；定量限

表4 回收率和精密度结果(n=6)

2.3.2 方法回收率及精密度

取空白小麦粉样品，选择低；中；高三个浓度水平进行加标，每个加标水平平行测定六次，计算六次加标实验的平均回收率以及相对标准偏差(RSD)，见表4。由实验结果可以看出，本方法回收率和精密度结果良好，回收率结果稳定在60%～120%之间，RSD小于15%，符合GB/T 27404—2008的实验室质量控制规范要求。

2.4 实际样品测定

根据本研究中建立的方法，对市场销售的9个不同品牌的小麦粉进行了真菌毒素测定，结果如表5所示。所全部9个试样品中，脱氧雪腐镰刀菌烯醇的检出率为100%，3-葡萄糖苷化-脱氧雪腐镰刀菌烯醇的检出率为89%，雪腐镰刀菌烯醇；玉米赤霉烯酮检出率为56%，伏马毒素检出率为33%。其中，呕吐毒素及其衍生物污染范围广，含量较高，是造成小麦粉真菌毒素污染的主要毒素，个别样品中的脱氧雪腐镰刀菌烯醇含量超过了国家标准GB 2761—2017中对小麦粉中脱氧雪腐镰刀菌烯醇的限量要求(<1 000 μg/kg)，应采取风险防控措施。玉米赤霉烯酮、伏马毒素在小麦粉中分布广泛，也应予以关注。

表5 小麦粉实际样品测定结果/μg/kg

注：“ND”为未检出。

3 结论

建立了同时检测小麦粉中28种真菌毒素的快速筛查方法。样品经过乙腈/水/甲酸溶液进行提取(80∶18∶2)，C18色谱柱进行分离，以0.1%甲酸的甲醇水溶液作为流动相，采用多反应检测(MRM)模式进行检测，外标法定量，可以实现28种真菌毒素的同时检测。本法具有操作简单；快速；成本低廉；毒素种类覆盖范围广的优点，检出限和定量限均能满足真菌毒素日常风险检测的需求，为小麦粉基质中真菌毒素检测提供了一种高通量、低成本、高效率的检测方式。