超高压-超声波协同法提取藜麦β-葡聚糖的工艺研究
2020-07-07邹佳文陈虹均陈祥贵黄玉坤
王 冲 邹佳文 陈虹均 陈祥贵,2 黄玉坤,2
(西华大学食品与生物工程学院1，成都 610039)
(食品非热加工重点实验室；食品非热加工工程技术研究中心；宜宾西华大学研究院2，宜宾 644004)
藜麦原产于南美洲，具有突出的保健作用与丰富的营养价值[1,2]，有“粮食之母”的美誉[3]。藜麦在甘肃、山西、青海、内蒙古等18个省、市、自治区都有广泛的种植[4]，我国藜麦产业发展起步较晚，因此在藜麦的生产、加工、产品研发等方面一直滞留在基础技术研究的层面[5]。梁军林等[6]研究发现藜麦中含有较多的β-葡聚糖。β-葡聚糖具有抗氧化、抑菌、降三高、增强免疫力等多种生理功能，在医药、化妆品以及食品产业中应用广泛[7,8]。虽然目前已有关于藜麦中黄酮类、多酚、皂苷、等生理活性物质的功能和提取条件的研究[9]，但对藜麦β-葡聚糖提取的研究还鲜有报道。目前，植物中β-葡聚糖的提取方法主要有水提法[10]、酸提法和碱提法[11,12]、酶提法[13]、冻融法[14]等。这些方法都存在不同程度的缺陷，如酸提法易造成藜麦中淀粉过度水解，从而使葡萄糖混入β-葡聚糖产品中，造成产品纯度偏低；碱法具有较好的提取效果，但通常需要耗费大量时间[15,16]。
近年来，由于超高压提取方法有助于缩减时间、提高提取效率，因此逐渐应用于食品中活性成分的提取。王谦等[17]利用超高压提取青稞β-葡聚糖，显著提高了β-葡聚糖的提取效率。超声波提取法在提取率高、省时节能的同时，还能保护产品的持水性和持油性，近年来已成功用于提取燕麦β-葡聚糖[18]。通过多种提取方法的结合，游茂兰等[19]提出了超声-微波协同法提取青稞中的β-葡聚糖，与水提法、超声法和微波法相比，β-葡聚糖得率分别提高了120.19%、57.93%、18.65%，展现了协同提取的较好效果。本研究利用超高压与超声波提取时间短、效率高的优点，建立了对藜麦中β-葡聚糖进行提取的超高压-超声波协同法。通过单因素及正交实验探究超高压-超声协同法提取藜麦β-葡聚糖的工艺条件，并与单一提取方法进行比较，确定藜麦β-葡聚糖提取的最佳方法，为藜麦资源开发利用提供参考。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
高原藜麦、β-葡聚糖标准品(≥95%，HPLC级)、耐高温α-淀粉酶(2 120 IU/g)、刚果红(≥98%，HPLC级)、胰蛋白酶(1∶250)，其他化学试剂均为国产分析纯。实验所用水符合GB/T 6682—2008《分析实验室用水规格和实验方法》的要求。
1.2 仪器与设备
UV-2800型紫外可见光光度计；SCIENTZ-ⅡD超声波细胞粉碎机；HPP600/5L超高压食品处理设备；RE-52AA 旋转蒸发仪。
1.3 方法
1.3.1 超高压-超声波协同提取藜麦β-葡聚糖
称取粉碎后的藜麦粉若干，按一定比例添加蒸馏水后混匀。调节pH10，进行功率300 W、15 min的超声波处理后装入双层高压袋中，封口后在超高压装置内以300 MPa处理4 min。离心(6 000 r/min、20 min)得到上清液，滤渣再重复处理1次。将2次上清液合并后调pH至6.0，以4 U/mL加入耐高温α-淀粉酶，95 ℃、30 min除去酶解淀粉。在溶液冷至室温后调其pH为8.0，以1∶50的体积比添加1%胰蛋白酶溶液在37 ℃、30 min处理后以90 ℃、10 min灭酶。溶液冷却后调pH至4.5，4 ℃静置12 h，离心(6 000 r/min、20 min)取上清液。加入上清液3倍体积的95%乙醇，4 ℃静置12 h后收集沉淀，冷冻干燥得到β-葡聚糖粗提物。
1.3.2 β-葡聚糖含量测定及得率计算
相较于酶联免疫试剂盒和苯胺蓝荧光检测法，刚果红法测定β-葡聚糖操作简单、较易实现[20]。实验选择刚果红分光光度法[21]测定β-葡聚糖含量，将冻干的β-葡聚糖复溶于蒸馏水中，稀释到一定倍数n后测定其吸光度。由标准曲线计算出样液中β-葡聚糖含量，并按式(1)计算β-葡聚糖得率：
(1)
式中：m为测定的藜麦中β-葡聚糖的质量/g；M为藜麦质量/g。
1.3.3 单因素实验
选择超声波功率、超声波时间、超高压压力、超高压时间、提取液pH、料液比为影响因素，研究各因素对实验结果的影响。
1.3.3.1 超声波功率对得率的影响
以超声时间15 min，超高压压力300 MPa，超高压时间4 min，料液比1∶15，pH10，研究超声波功率分别为200、300、400、500 W时对藜麦β-葡聚糖得率的影响。
1.3.3.2 超声时间对得率的影响
以超声波功率300 W，超高压压力300 MPa，超高压时间4 min，料液比1∶15，pH10，研究超声时间为9、12、15、18、21 min时对藜麦β-葡聚糖得率的影响。
1.3.3.3 超高压压力对得率的影响
以超声波功率300 W，超声时间15 min，超高压时间4 min，料液比1∶15，pH10，研究超高压压力为200、250、300、350、400 MPa时对藜麦β-葡聚糖得率的影响。
1.3.3.4 超高压时间对得率的影响
以超声波功率300 W，超声时间15 min，超高压压力300 MPa，料液比1∶ 15，pH10，研究超高压时间为3.0、3.5、4.0、4.5、5.0 min时对藜麦β-葡聚糖得率的影响。
1.3.3.5 料液比对得率的影响
以超声波功率300 W，超声时间15 min，超高压压力300 MPa，超高压时间4 min，pH10，研究料液比为1∶12、1∶15、1∶18、1∶21、1∶24时对藜麦β-葡聚糖得率的影响。
1.3.3.6 pH对得率的影响
以超声波功率300 W，超声时间15 min，超高压压力300 MPa，超高压时间4 min，料液比1∶15，研究pH为8、9、10、11、12时对藜麦β-葡聚糖得率的影响。
1.3.4 正交实验
在单因素实验的基础上，选择4个影响较大的因素并各取3个水平，采用L9(34)正交实验对β-葡聚糖的提取工艺进行优化，实验因素与水平见表1。
表1 超声波-超高压协同法因素水平表
1.4 不同提取方法对比实验
分别采用水提法[料液比1∶15(g/mL)、提取温度60 ℃、提取时间1.5 h、pH 10]、超声法(超声功率300 W、超声时间15 min)、超高压法(超高压压力300 MPa、超高压时间4 min)和本研究中的超声波-超高压协同法提取藜麦β-葡聚糖，比较不同方法间的提取效果，其中超高压和超声波的提取条件选择正交优化的结果。
2 结果与分析
2.1 β-葡聚糖含量的标准曲线
以β-葡聚糖含量20、40、60、80、100 μg为横坐标，吸光度值为纵坐标，绘制标准曲线，结果如图1所示。吸光度与β-葡聚糖含量的相关性方程为y=0.025x+0.078，相关系数为0.997 6，表现出良好的相关性。
图1 β-葡聚糖测定标准曲线
2.2 单因素实验结果分析
图2显示了各个因素对β-葡聚糖得率的影响。超声时间12 min时得率显著高于其他超声时间时的得率，超声时间大于12 min后得率明显下降。在一定的超声时间内，超声时间的延长使得溶液的振动时间延长，有利于β-葡聚糖的溶出；但超声时间过长会增大超声波作用强度，使β-葡聚糖的降解程度加大，导致β-葡聚糖得率下降[22]。因此，超声时间考虑为12 min。
在超声功率为200～300 W时，β-葡聚糖的得率随着功率的增大而增大，在功率大于300 W后，得率逐渐下降。由于超声功率较小时，超声波的空化作用随着功率的加大而增强，有利于原料组织破碎。超声功率的增加加速了溶液的水循环，使得β-葡聚糖更容易溶出和扩散到溶液中。当超声波功率过大时，藜麦中非糖类杂质溶出和β-葡聚糖的降解程度变大，使其得率降低[23]。当超声功率为300 W时β-葡聚糖的得率显著高于其他实验组，因此，超声波提取时功率选取300 W。
在超高压时间为4 min后继续超高压处理，β-葡聚糖得率无显著变化。这可能由于4 min 后细胞已基本破裂[24]。因此，加压时间选择4 min。在压力小于300 MPa时，β-葡聚糖得率随压力增加而显著增加，而达到300 MPa后继续增加压力，β-葡聚糖得率无显著变化。一定的超高压压力使细胞发生破裂，溶剂溶出 β-葡聚糖，300 MPa后细胞破裂完全，更高的压力对提取影响不大且增加耗能[19]。因此，选择300 MPa的压力。
β-葡聚糖是一种可溶于弱酸性和弱碱性溶液中的可溶性纤维，在不同pH溶液中 β-葡聚糖的溶解度不同。β-葡聚糖得率在pH10时达到最大值，呈现明显的先增后减趋势。由于β-葡聚糖本身具有碱溶性，碱性较强时有利于其从细胞中溶出，提高提取率；但β-葡聚糖在强碱性条件下发生糖苷键的断裂，并且溶液中杂质的增多增加了溶液黏度，使β-葡聚糖溶出受阻[18]，降低了β-葡聚糖得率。因此，选择提取的pH为10。
在料液比1∶12～1∶18之间增加溶剂用量可显著提高β-葡聚糖得率。料液比达到1∶18后，增加溶剂用量，β-葡聚糖得率变化不显著。增大溶剂量有利于溶质的析出和扩散，当溶质的析出达到一个动态平衡后，继续通过加大溶剂的量来提高溶质的析出量的意义不大[19]。因此，采用1∶18的料液比。
注：同一曲线不同小写字母表示各处理组间差异显著(P<0.05)。
图2各单因素对得率的影响
2.3 超声波—超高压协同法正交实验结果分析
从表2可以看出，影响藜麦中β-葡聚糖得率的主次顺序为超声功率(A)>超高压压力(C)>超高压时间(D)>超声时间(B)，且可确定提取藜麦中β-葡聚糖工艺的最佳参数为A2B3C2D1，即超声功率为300 W，超声时间为15 min，超高压压力为300 MPa，超高压时间4 min，根据此参数得出的β-葡聚糖得率为1.66%。
2.4 不同提取方法的效果比较
超高压-超声波协同法、水提法、超声法和超高压法提取β-葡聚糖的得率分别为1.66%、0.64%、1.16%、1.34%，超高压-超声波协同法得率较后三者分别提高了159.38%、43.10%、23.88%。如图3所示，超高压-超声波协同法显著提高了β-葡聚糖的得率(P<0.05)。
表2 协同法正交实验结果及分析
注：相同字母表示差异不显著，不同小写字母表示各处理组间差异显著(P<0.05)，不同大写字母表示各处理组间差异极显著(P<0.01)。
图3不同提取方法的效果比较
3 结论
在利用碱性溶剂提取葡聚糖的同时，结合超高压与超声波时间短、效率高的优点对藜麦中的β-葡聚糖进行提取。超高压-超声波协同法提取β-葡聚糖的最佳工艺条件为：超声功率300 W，超声时间15 min，超高压压力300 MPa，超高压时间4 min，水提pH10，水提料液比1∶18。在最优条件下，得出超高压-超声波协同法的提取率为1.66%，与水提法、超声法、超高压法相比，提取率分别提高了159.38%、43.10%、23.88%，超高压-超声波协同法提取β-葡聚糖得率显著提高。由此可见，超高压-超声波协同法在藜麦β-葡聚糖的提取应用中具有较大潜力。
