追溯动物克隆的历史：一个跨世纪的问与答

任敬宇，徐 华，朱 捷，3*

（1.内蒙古大学 生命科学学院，呼和浩特 010021；2.河北省廊坊市农业局，河北 廊坊 065000；3.河北省廊坊市六骥公司，河北 廊坊 065000）

1996年7月5 日世界上第一只体细胞克隆绵羊-多莉（Dolly）在英国苏格兰爱丁堡郊外的罗斯林研究所诞生。她的降生不仅开创了动物繁殖生物学的新篇，而且也为动物胚胎干细胞的理论及其利用和后来诱导干细胞（induced pluripotent stem cells，iPSCs）方法的建立提供了理论基础和实践。同时，动物的体细胞克隆技术及其衍生的胚胎干细胞和干细胞定向分化技术为一个崭新的领域——细胞治疗与修复医学（regenerative medicine）奠定了理论基础和可能。为千千万万位患者，特别是很多细胞退型性疾病（如脑瘫、帕金森病等）的患者带来福音。目前，动物试验结果已经表明，应用克隆技术不仅可以有效治疗这些疑难病症，而且能够使患病动物完全康复。然而，和其他重大科学发现一样，体细胞核移植技术的发展也是经历了一代一代科学家一个多世纪的艰难探索才取得了今天的成绩。在这艰难探索的道路上，涌现出许多优秀的科学家，其中包括两名诺贝尔奖获得者和他们感人的故事。以下将介绍一些在一个多世纪中为寻找科学真理而做出重要贡献的科学家们以及他们背后的故事。

1 故事的起源

德国生物学家AugustWeissman（全名是August Friedrich Leopold Weismann）1834年1月17日出生于德国法兰克福（Frankfurt），1914年11月5日死于德国福莱博格（Freiburg）。他一生致力于生物学的研究，是遗传学和DNA学说建立的先驱者之一。他反对后天性状遗传学说，并创立了“种质”理论（“germ plasm”theory）。早在1885年他就提出了一个假说，即胚胎细胞的部分种质（germ plasm，相当于基因组）将会随着胚胎细胞在发育的过程逐渐失去，而决定细胞最终发育的那些种质将被保留下来［1］。这个假说意味着一个分化了的细胞核将无法重新控制整个后代的发育，因为它已经不再具有所有细胞发育所需要的种质结构。也就是说，胚胎细胞分化的过程是不可逆的！从那时起，一代代科学家们围绕这个假说进行了大量的科学试验，并取得了显著的进展。然而一个世纪过去了，科学家们始终无法得到完美的答案。直到“多莉”出生，这一跨世纪的假说才有了最完美的答案。

2 早期的探索

无性繁殖的英文名称叫“clone”，译音为“克隆”。实际上，英文“clone”起源于希腊文“klone”，原意是用“嫩枝”或“插条”繁殖。时至今日，“克隆”的含义已不仅仅是“无性繁殖”，凡来自一个祖先、经过无性繁殖出的一群个体，也叫“克隆”。对动物克隆而言，克隆的方法有早期胚胎卵裂球的分离、胚胎的切割、细胞核移植等。由于受到诸多条件（如培养液和培养环境）的限制，早期的试验主要停留在低等动物上，如海星、爬行动物与两栖动物。19世纪末20世纪初，一位德国实验科学家Wilhelm Roux（1850—1924）［2-3］于1885年损毁2-细胞青蛙胚胎中的一个卵裂球，发现未被损毁的卵裂球仍然可以发育成一个正常个体。此后，另一位德国的哲学家和发育生物学Hans Driesch（1867—1941，全名Hans Adolf Eduard Driesch），于1891年将2-细胞的海星卵分离成两个单个卵裂球，而这两个单个的卵裂球分别发育成两个单独的正常海星幼体。此后，他又采用4-细胞海星卵做了同样的试验，并取得了相似的结果。结果表明，至少在分裂成4-细胞的海星胚胎中每一个卵裂球仍然具有与1-细胞受精卵相同的发育潜力［4］。可能是随着细胞分裂次数的增加，试验的难度也大大增加，遗憾的是他并没有将试验继续下去。

另一位德国胚胎学家和解剖学家August Antonius Rauber（1841—1917）［5］可能是世界上第一位提出核移植的概念并且亲自实践的科学家。1886年他采用两支注射器在受精后1小时时，将1只青蛙和蟾蜍受精卵的细胞核进行了交换。不出意外，这次试验以失败告终。2个互换核的细胞都停止发育，并没有分裂。不过，Antonius Rauber推测这样的核移植细胞应该具有可遗传性。几乎就在同一时期，美籍德国生物学家Jacques Loeb（1859—1924）在采用不同的盐浓度进行海星卵子孤雌激活的试验时偶然发现，一些早期胚胎产生了很大的水泡［3］。而这个水泡有着特殊的性质，即当胚胎其他部分仍在发育时水泡并没有发生任何的变化。后来他观察到，当将1个细胞核移入水泡中时，这个水泡也开始发育。如果把这个水泡与它所在的胚胎分离，分离的水泡仍然具有独立发育的潜能。这一发现表明，通过细胞核之间的移动可以创造新的胚胎。他的发现为现代核移植技术的发展以及后来利用物种之间的核移植研究进化过程奠定了基础。他认为任何低等动物的所谓本能只不过是物理化学反应，他称之为趋向性。在Jacques Loeb试验的基础上，法国动物学家Yves Delage（1854—1920）又将试验向前推进了一步。他采用化学方法激活海星卵子，并且发展了培养孤雌激活海星卵子的方法。然而他的贡献主要集中在理论上。他认为，细胞分化是来自同一细胞所产生两个子细胞细胞质成分不同导致的。他还推测“每一个核，至少在发育成个体之前相当于一个受精卵的细胞核。假如没有任何退化的话，这个卵的核应该可以被任何一个正常胚胎的细胞核所替换，我们大概应该可以看到这个卵可以正常的发育，不会有任何的变化”。这样的表述已经非常接近现在核移植的概念（将一个细胞核植入一个去核的卵子中）。但遗憾的是他并没有给出具体实施核移植的方法［6-7］。而他的这个预言以及核移植的概念直到大约60年后才被Briggs和King所验证［8-9］。

和以前的海星试验不同，德国胚胎发育学家Hans Spemann（1869—1941）采用一种爬行动物——蝾螈（salamander）作为试验材料，成功重复了前人在海星试验中所观察到的结果。因此，他也被公认为“克隆之父”［10］。不仅如此，他还建立了胚胎显微操作方法，并进行了大量试验，进而发现了胚胎发育过程的“组织效应”（Organizer-Effect），也被称为Spemann理论。由于这些开创性的研究成果，1935年Hans Spemann被授于诺贝尔生理和医学奖。Spemann的核移植试验示意图见图1。

Hans Spemann的很多经典试验至今仍然被人们津津乐道。例如，他用出生不久女儿的头发所做的核移植实验，即“延迟成核实验”（delayed nucleation experiment）被称之为“梦幻实验”（fantastical experiment）。他用女儿的头发控制一个正在发育的蝾螈1-细胞受精卵的细胞核，然后将头发系紧此受精卵，使之分为一边含有1个核，另一边只有细胞质，而没有细胞核。当含有核的部分分裂4次后，即16-细胞时期，小心地放松头发，使一个核释放进入只有细胞质的部分。然后再次系紧这个胚胎，并使之一分为二，其中一部分含有15个核，而另一部分仅含有1个核。最后，被头发分开的这两部分胚胎分别发育成两个正常的蝾螈。他的试验再一次证明，一个分裂4次的蝾螈胚胎细胞核仍然具有全能性（totipotency），也就是说，至少来自16-细胞蝾螈胚胎的细胞核并没有失去发育能力。显然，这样的结果并没有支持AugustWeissman的假说。但是这些结果仅仅证明对海星及蛙类早期胚胎而言，16-细胞胚胎中的每个卵裂球仍然具有全能性，但是并不知道这些动物16-细胞后的核是否仍然具有同样的能力。因此，1938年Hans-Spemann又明确地提出，当体细胞核被植入一个胚胎细胞中是否能够发育成一个新的生物体的问题［3］。Hans Spemann的问题是August Weissman假说的发展，也更具挑战性。

3 两栖动物细胞的核移植

在20世纪初，动物胚胎学包括核移植研究经历一个快速的发展时期之后，核移植的研究又处于一个相当长的停滞期。直到1952年，美国发育生物学家RobertWilliam Briggs（1911—1983）和他的助手Thomas Joseph King Jr.（1921—2000）在《美国科学院院报》发表了题为《青蛙囊胚核移植去核卵子的研究》论文［8］，引起了科学界的震动。他们不仅仅将囊胚期的细胞核移植入去核的卵子中，而且成功获得了可正常发育的蝌蚪。他们的成果被称之为人类历史上第一次真正动物核移植的成功。RobertWilliam Briggs和Thomas Joseph King Jr.，前者动脑，富有远见，而后者动手，心灵手巧，两人的合作真可谓是“珠联璧合”。他们之所以取得成功，其中一个很重要的原因是就在于他们选对了适合的试验动物——北美豹蛙（North American leopard frog Rana pippiens）。北美豹蛙体外排卵，卵细胞体积大，非常便于实验操作。而且受精卵中的每个细胞核很易分离，更重要的是北美豹蛙受精卵在水中能成长发育，对培养条件要求很低。和很多天才科学家相比RobertWilliam Briggs有着艰难曲折的人生经历。在他两岁时母亲和兄弟因患结核而双双去世，他是由爷爷与奶奶带大。在上中学时他跟随姑姑学习钢琴，并对音乐产生了浓厚的兴趣。可是在经济大萧条时期，即便是在中学期间，因生活所迫，他也不得不利用暑假去鞋厂做工，冬季则做为一名五弦琴手参加乐队在新罕布什尔州南部（Southern New Hampshire）巡回演出。在中学时他受到了生物学老师的启发，对生物学产生了浓厚的兴趣。然而由于生活所迫，1929年中学毕业以后，他选择进入波士顿大学的商业行政学院学习，而并没有选择自己喜爱的生物学。然而入校不久，他发现自己对商学课程没有兴趣，转而去文科学院学习有关科学的课程。在经过仔细考虑之后，Briggs选修了许多教育学院有关教授科学的课程，希望毕业后能够成为一名教授科学的老师。1934年Briggs从波士顿大学获得了科学学士学位，后进入哈佛研究生院开始了蛙类发育生物学的研究。1938年他被哈佛大学授于了博士学位。1938—1942年他在加拿大McGill大学动物系从事蛙类癌症的研究。1942年他进入美国Lankenau医院研究所（后来更名为癌症研究所和Fox Chase癌症中心）从事与蛙类癌症相关的基础研究。1952年Briggs和Thomas J.King合作，成功地将未分化的囊胚细胞核植入一个去核的卵子中，并得到了可发育的正常后代［8］。他们所改进的核移植方法也为后来体细胞核移植的研究奠定了技术基础。他们也因此获得了很多的奖项，其中最重要的是1973年法国科学院颁发的Charles-Leopold Mayer奖，这是法国科学界的最高奖，也是法国第一次颁发给法国以外的科学家。然而，1977年Briggs和King做了一系列的核移植试验表明，当采用囊胚细胞核作为供体核时，核移植后产生正常蝌蚪的效率是35%；如果采用晚期原肠胚内胚层（late gastrula endoderm）的细胞，其效率仅为6%；而采用神经后期或以后期（post-neurula or later stages）细胞核移植的细胞将停止发育。这些结果表明，供体细胞的分化程度和核移植之后的效率呈负相关。因此，他们得出结论：分化了的蛙胚胎细胞无法正常回到胚胎的原始状态，即全能态（totipotency）［9，11］。

不久，这个结论很快就被另外一位英国生物学家John Bertrand Gurdon所改写。1958年John Gurdon和他的导师Michael Fischberg博士在自然杂志上发表了他博士论文，题为“体细胞核移植可以产生性成熟的非洲有爪蟾蜍”［12］。他们首次证明，非洲有爪蟾蜍的体细胞具有与受精卵一样的基因。通过核移植分化了的非洲有爪蟾蜍的细胞核仍然可以回到胚胎发育的起点。经历了半个多世纪，2012年John B.Gurdon终于迎来了属于他的高光时刻，他被授予当年的诺贝尔生理和医学奖。和Briggs教授不同的是，John Gurdon1933年出生于一个贵族家庭，从小就受到了良好的教育。但他并未像很多天才科学家那样很小就显露出聪颖的天资。相反，他被认为是一位头脑不正常的孩子。在他刚上当地的一所私立小学时，一次智力测验老师让学生们画一个橘子，John Gurdon由于吃、住、行从小一切由母亲安排，从未见过橘子。他只好画了一支树枝，暗示橘子是生长在树上的。当老师看到卷子后，气愤地将他的卷子撕了，并告诉他的父母，他们的儿子智力有问题，需要接受特殊教育。无奈，他的父母只好把他转到另外一所私立小学学习。John Gurdon的中学时代是在英国最著名的伊顿公学院，也是英国最有名的贵族中学度过的。在中学时期，尽管他对动物和昆虫表现出极大的兴趣，但是他的生物学在250名同龄学生中成绩垫底，以致于老师不得不取消了他继续学习生物学的资格，而让他由理科改学文科的拉丁语、古希腊语以及现代语言等语言类课程。他的生物学老师甚至在评语中写到，他想成为一名科学家的梦想简直就是“异想天开”。当他中学毕业报考牛津大学时，由于他缺少生物学的成绩而被拒绝参加理科的入学考试，只能去报考文科专业。但他又不愿意放弃动物学。无奈，通过在牛津大学工作的亲戚的“后门”，John Gurdon终于可以有条件地参加理科的入学考试。条件是他必须在一年内补习他所欠缺的《生物学》并达到要求，他的父母还专门为他请了私人教师给他补习。功夫不负有心人，后来他终于被动物系有条件录取。他必须在第一年的预科期内通过物理、化学和生物等基础学科考试后才能开始正式学习。这种事在现在的牛津大学再也不可能发生。幸运的是John Gurdon最终达到了这些要求并开始了牛津大学动物系的学习。在大学期间，John Gurdon对昆虫非常感兴趣，并希望将来攻读昆虫方向的博士。因此，他报名参加了系里组织的项目，去大学的自然保护区调查昆虫物种的种类与数量。在野外采样期间，John Gurdon捕捉到一种他无法确定的蝇。于是他将蝇送到位于英国伦敦的自然历史博物馆，请那里的研究人员帮助鉴定。然而博物馆的研究人员抢先公布，这种蝇是一种在英国首次发现的新物种。这件事让大学主持这一项目的教授非常恼火。自然他想做昆虫方向博士的梦想也随之破灭。不过，他幸运地得到了当时还是牛津大学动物系教发育生物学讲师Michael Fischberg博士的邀请，在他的名下攻读博士学位。巧合的是Michael Fischberg博士导师的导师正是大名鼎鼎的诺贝尔奖获得者Hans Spemann教授的学生。真可谓名师出高徒！1956年John Gurdon开始了他的博士论文工作。Michael Fischberg博士建议他采用非洲爪蟾为试验动物开展体细胞核移植的研究，而不是延用北美豹蛙。因为和北美豹蛙相比，非洲爪蟾的繁殖期更短，不仅全年繁殖，而且可以超数排卵。在博士研究的开始阶段，John Gurdon花了一年的时间建立和完善蛙体细胞核移植的体系。他成功地改进了蛙卵的去核效率，运用紫外线照射的方法摧毁染色体，而不损伤卵子细胞质本身，同时也克服了细胞膜外胶状物对注射细胞时所产生的干扰。另外，他的导师发现了一个非洲爪蟾的突变型，使用这种突变体的卵子可以使去核的效率大大提高。这些改进为后来的体细胞核移植的成功奠定了技术基础［13］。此后，他将自己的全部热情都投入到了试验中，并将Briggs的结果又向前推进了一步。他采用蝌蚪的小肠上皮细胞作为核移植的供体细胞，将它移入去核的蛙未受精卵中，并成功地得到了正常发育的后代，并且这些后代可以发育至性成熟阶段。他将这些结果以“可育的小肠细胞核”为题发表在《自然》杂志上［14］。这是发育生物学发展中一个具有划时代意义的里程碑，它标志着身体中所有的细胞都含有同样完整的一套基因，从而回答了发育生物学中长期悬而未决的重要问题。同时也明确说明卵子具有将体细胞转化为胚胎细胞状态的“魔力”。不仅如此，这种现象也引起了人们的极大兴趣，并导致体细胞置换即核移植概念的产生。

尽管这些在两栖动物所取得的成绩已经说明AugustWeissman早期的假说是不正确的，然而JohnGurdon采用成年蛙的体细胞所作的核移植试验，尽管可以产生蝌蚪，但未能变成成蛙［15-16］。这暗示着非洲爪蟾体细胞核移植有一定的局限性。1950—1970年，胚胎发育学的发展包括精子获能的发现、胚胎体外培养技术开始建立，以及分子生物学特别是DNA双螺旋结构的发现，使得哺乳动物的核移植成为了可能。人们很自然地提出，当采用哺乳动物的细胞核进行核移植时，核移植的胚胎是否也遵循与两栖动物核移植同样的规律呢？绝大多数科学家持悲观或否定态度，因为从进化论的观点来看哺乳动物的基因与两栖动物的相比更“保守”。

4 哺乳动物细胞的核移植

在1960—1970年间，由于小鼠、兔、羊、牛和猪的超数排卵、卵子的回收以及胚胎移植等技术已经广泛被使用，同时，卵子和胚胎的体外培养技术也获得了突破，这些都为哺乳动物核移植工作的开展创造了必要条件。1978年，波兰生物学家Modlinski等首先将一个8-细胞期小鼠胚胎细胞核通过显微操作的方法注射到一个完整的受精卵中，从而得到了发育到囊胚的4倍体胚胎［17］。此后，Modlinski采用了未受精卵做为供体核的受体细胞，但并未得到可发育的胚胎［18］。1981年，美国生物学家K.Illmensee和P.C.Hoppe［19］将小鼠内细胞团的细胞核注入到去核的小鼠受精卵中并产生了3只克隆的后代。但遗憾的是，这个结果并没有能被重复。1984年，J.McGrath等［20］将小鼠发育后期胚胎卵裂球的核移入去核的受精卵中并不能支持核移植胚胎的体外发育。因此，根据现代哺乳动物核移植技术的操作方法，哺乳动物真正意义上的核移植成功是由美国发育生物学家J.McGrath和D.Solter［21］取得的。他们用灭活的仙台病毒（Sendai virus）将小鼠1细胞受精卵的核与去核的受精卵融合，核移植细胞的存活率为90%，与对照组相比并没有下降。当将这些核移植胚胎植入受体后，其后代出生率与对照组相比没有明显下降。但是随着细胞核分化程度的不断提高，如2-、4-、8-细胞和内细胞团的细胞核用于供体核时，核移植胚胎的发育率明显下降。而用8-细胞胚胎以后的细胞核做为供体核时，甚至没有核移植的胚胎发育至囊胚。此后，他们采用未受精卵做为供体核的受体细胞，但未能得到可发育的胚胎（因为核移植的细胞需要被激活后才能发育）。根据这些试验结果得到结论：通过简单的核移植进行哺乳动物的克隆在生物学上是不可能的。此后，哺乳动物核移植技术有了较快的发展。如1987年R.S.Prather等［22］通过2-8细胞期牛胚胎卵裂球作为供体细胞核，将它移入体内成熟、去核的卵母细胞中，移植后2只正常的犊牛顺利诞生。几乎在同一时间Y.Tsunoda等1987年［23］也通过移植4-8细胞小鼠胚胎的卵裂球到2细胞期去核的受精卵，成功地获得了正常的后代。但他们用同样的方法移植囊胚内细胞团的细胞核，并未得到可发育的胚胎。这些试验结果表明，使用受精卵与未受精卵用于受体细胞时核移植的效率是不同的。而未受精卵效率好像更高。因此，核移植技术中，去核的MⅡ时期卵母细胞被广泛用于供体核的受体细胞。不过，正常情况下，受精卵的激活是由精子激发的，而当采用去核的MⅡ卵母细胞为受体细胞时，由于核移植后的细胞没有精子的参与，这样的细胞必须要被人工激活的方法激活后才可获得发育的能力。从技术角度来说，这一变化使核移植方法变得更加复杂，技术也要求更高。从那时起，哺乳动物核移植技术研究再次陷入了低谷。直到1995年，K.H.Campbell（全 名 Keith Henry Stockman Campbell，1954—2012）等［24］用绵羊囊胚体外培养9 d以上的细胞核成功地克隆了两只健康的小羊，被命名为Morag（摩拉）和Megan（梅根）。紧接着1996年7月5日他们又用体外培养的胎儿成纤维细胞和6岁怀孕母羊乳腺细胞，采用同样的方法又成功地克隆出健康的后代，其中就包括世界最著名的“多莉”［25］。在这项科学历史性的突破中被称为科学奇才的K.H.Campbell作出了杰出的贡献［26］。K.H.Camp-bell 1954年5月23日出生于英国中部城市伯明翰。尽管父母离异对年幼的他产生了很大的不良影响，但他从小就显露聪颖的天赋，从中学到大学他都获得了优异的成绩。他毕业于伯明翰爱德华国王11世男子中学（King Edward VI Grammar School）。1978年他毕业于伦敦伊丽莎白女王学院并获得了微生物学的学士学位。在大学学习期间，他开始对细胞生长及分裂的调控即细胞周期产生了浓厚的兴趣，这也为他后来的科学研究打下了坚实的理论基础。此后他又作为主要的实验技术人员被派往南也门工作了一段时间。回国后在英格兰Surrey以居里夫人命名的研究所工作。1983年他获得了“居里夫人奖学金”，开始了他在英国Sussex大学攻读博士学位的研究工作。他的主要研究方向是酵母菌以及卵子早期发育时细胞质与核的调控。1986年他顺利获得博士学位。那段时间他阅读了大量的文献，对于分化了的体细胞不可逆定律产生了怀疑。正像他所说的，尽管他博士论文的主要研究对象是真核生物和两栖类的蛙，但他始终坚信，很多适用于真核生物和两栖类的规律也可能适用于哺乳动物。正是怀着这样的梦想，在经历了两次博士后研究之后，他于1991年进入了威尔慕特博士（Dr Ian Wilmut）领导的科研小组，开始了他梦寐以求的、具有创造性的哺乳动物体细胞核移植的研究。向AugustWeissmann假说的最后一个难题发起了挑战。他将控制细胞周期理论创造性地应用到哺乳动物体细胞核移的研究当中，为哺乳动物的核移植技术带来了史无前列的变革。多莉吸引了全世界人的目光。然而从技术角度而言，真正意义上的突破确是梅根和摩拉，而并非人们关注的多莉。因为多莉仅仅是在前者基础上的延续而已。1997年Campbell离开了罗斯林研究所（The Roslin Institute）进入英国PLL Therapeutics生物技术公司。在那里他将自己的理论和技术应用于转基因的家畜生产上，特别是在克隆猪的研究中，他又一次向世人展现了自己的才华，他创造性地采用了两次核移植的方法有效地克服了卵母细胞激活效率低的难题，为世界第一批体细胞克隆猪的成功做出了重要贡献［27］。1999年他又离开了PLL公司，受聘于英国诺丁汉大学，成为动物生物技术及动物干细胞研究的教授，直至2012年10月5日突然离世。这位年仅58岁的科学界巨星的陨落让世人为之震惊，也让后人为之惋惜。因为在体细胞核移植领域所做出的突出贡献，他曾先后多次获奖。2008年他和威尔慕特（Ian Wilnut）教授以及在诱导干细胞领域做出重大贡献的日本胚胎干细胞科学家Shinya Yamanaka教授，被授予了“东方诺贝尔奖”之称的Shaw奖。

5 结语

多莉的出生给100多年前AugustWeissman的假说以最完美的回答，即所有动物（包括哺乳动物）的细胞包括分化了的体细胞都具有相同的基因组，并且都具有重编程（reprogramming）重新回到胚胎初始状态（totipotency）的潜力。为回答这个假说无数科学家不断探索和创新，终于为这一困扰人们一个多世纪的难题划上了完美的句号，并为在此基础上建立起来的干细胞生物学以及相关领域学科的发展翻开了崭新的一页。毫无疑问，这些为人类科学事业做出巨大贡献的科学家及他们为科学事业所做出的成绩将被人们永远铭记。他们为科学事业忘我献身的精神将激励着一代又一代的年轻科学家为探索科学的真理而继续奋斗。