羊肌内脂肪含量分子标记及其在肉羊品种培育中的应用

2020-07-07刘学峰李信涛佟桂芝王伟霞

黑龙江动物繁殖 2020年1期

刘学峰，李信涛，佟桂芝*，朱贵，王伟霞，海龙

（1.黑龙江省农业科学院畜牧兽医分院，黑龙江齐齐哈尔 161005；2.吉林省农业科学院畜牧科学分院，吉林公主岭 136100）

美利奴羊是细毛绵羊品种的统称，在世界各地广泛饲养，多年后衍生出了诸多毛用、毛肉兼用、肉毛兼用品种。德国美利奴羊是我国自20世纪50年代起就开始引进养殖的优秀肉毛兼用品种，在生长周期、繁殖性能、适应性、产肉性能上均有良好的表现，养殖实践中也已经与多种细毛杂种羊和本地羊尝试杂交以进一步改良品种。针对德国美利奴羊肉质上的不足，使用分子标记高效筛选优良肉质个体用于繁殖和育种，是进一步改善德国美利奴羊品种的高效途径［1］。

肌内脂肪（IMF）是羊肉肌肉风味的主要指标之一［2］。在正常范围内，肌内脂肪含量与羊肉的鲜嫩度、口感风味和多汁性呈直接正相关关系［3-5］，肌纤维之间沉积一定量脂肪时大理石纹增加，肉质鲜嫩性和多汁性得到改善［6］。研究表明，遗传上肌内脂肪含量与瘦肉率呈负相关，因此，培育高瘦肉率兼高肌内脂肪含量（即肉质口感良好）的羊品种理论上完全可行。但羊（特别是具体品种羊）的肌内脂肪含量分子标记的筛选工作目前开展尚不多。肌内脂肪含量和脂肪酸组成对绵羊肉品质有影响［7-8］。脂肪的硬度受肌内脂肪及脂肪酸组成等影响，进而影响脂肪的营养价值、风味以及食用品质，而脂肪酸组成受动物种类、品种、性别等因素影响［9］。羊肌内脂肪含量是影响羊肉品质的一个重要因素，其调控机制非常复杂，主要受营养、环境和遗传等多方面的影响，其中基因调控是改善羊肌内脂肪沉积的根本途径之一［10］。

1 德国美利奴羊CAPN1和CAPN2（钙蛋白酶1和钙蛋白酶2）多态性位点的发现

CAPN是一种细胞内普遍存在的巯基丙氨酸蛋白内切酶。现有研究表明，CAPN（特别是CAPN1）在某些牛和羊种类中与肉嫩化过程相关。试验拟以此为基础，研究德国美利奴羊CAPN多态性及其与肌内脂肪的关联。

试验动物选择自有养羊场内健康、成年纯种德国美利奴羊355只，屠宰前颈静脉采血5 mL，加入含抗凝剂的离心管中保存于-20℃。屠宰后取背最长肌肉样于-80℃保存。

采用索氏抽提法，检测羊背最长肌肉样的肌内脂肪含量：1）将3～5 g样品在液氮中研至细粉，装入称重过的烘干滤纸包中，称含湿样的滤纸包重，干燥2 h后称含干样的滤纸包重；2）使用索氏抽提器室温下乙醚抽提6 h；3）乙醚挥发后，将滤纸包干燥2 h后称重。计算公式：肌内脂肪含量＝（含干样滤纸包重-抽提后干燥滤纸包重）／（含湿样滤纸包重-滤纸包干重）。

分子生物学试验部分委托北京微阅基因技术有限公司进行。

使用酚-氯仿法提取血液样品DNA，琼脂糖凝胶电泳检测DNA浓度后保存于-20℃。

根据GenBank上绵羊CAPN1和CAPN2的序列信息（NM_001127267和NM_001112817，见本申请SEQ ID NO.1-4）使用Primer Premier 5.1设计引物扩增，并进行PCR-SSCP分析。结果发现CAPN1上C724A（Leu-Met，均为非极性氨基酸）和CAPN2上A601G（Thr-Ala，由极性氨基酸变为非极性氨基酸）两个与肌内脂肪相关的多态性位点。

2 多态性位点的基因型频率和等位基因频率

见表1。

表1 CAPN1上C724A和CAPN2上A601G的基因型频率和等位基因频率 %

德国美利奴羊群在两个多态性位点处于Hardy-Weinberg平衡状态（P＞0.05）。CAPN1上C724A属于低度多态性位点，CAPN2上A601G属于中度多态性位点。

3 不同基因型与肌内脂肪含量的关联

见表2。

表2 不同基因型与肌内脂肪（背最长肌）含量的关联 %

两个位点背最长肌肌内脂肪含量最小二乘均值的关系分别为CC＜CA＜AA，AA＜AG＜GG，CAPN1 724位置处AA与CC、CA与CC之间均差异极显著（P＜0.01），CAPN2 601G位置处GG与AA之间差异极显著（P＜0.01），而AG与AA之间差异不显著（P＞0.05）。说明两个多态性位点均有较好的作为品种培育分子标记的潜力。

4 多态性分子标记用于德国美利奴羊品种培育实践

确定多态性位点后，将种羊颈静脉采血样本送至北京微阅基因技术有限公司，以SEQ ID NO.5-8的引物扩增后测序检测CAPN1上C724A和CAPN2上A601G处基因型。以基因型为标准选取CAPN 1 724位置上基因型为AA和CAPN 2 601位置上基因型为GG的种公羊3只、母羊25只，CAPN 1 724位置上基因型为CA和CAPN 2 601位置上基因型为GG的种公羊4只，将上述公羊和母羊用于自然交配繁殖。统计6月龄时样本中背最长肌和臀大肌中肌内脂肪，平均值为（9.67±0.31）%、（5.75±0.25）%。从经验上看，超过本实验室之前所养德国美利奴羊同期水平（约1.6%和0.7%），口感得到了一定提升，同时体重、羊毛等性状无显著变化。虽然尚未得到完全成年后的肌内脂肪数据，但本研究分子标记辅助选择的实践效果也已经较为明确。