慢性鼻窦炎伴鼻息肉组织中17β-HSD1/17β-HSD2的表达

赵影颖，阎小军

(上海交通大学医学院附属第九人民医院，上海 200011)

慢性鼻窦炎伴鼻息肉是常见的上呼吸道慢性炎性疾病，糖皮质激素是首选的治疗药物[1].研究[2]发现：激素结合球蛋白及相关活性酶均会影响其生物利用度，与激素的生物学效应密切相关.17β-羟基类固醇脱氢酶(17β-HSD)是人体中广泛存在的激素活性酶，包括17β-HSD1、17β-HSD2两种亚型，影响细胞和组织中的活性激素含量，介导细胞中激素发挥抗炎等生物学效应[3].17β-HSD1能够将无活性的激素转化为有活性，而17β-HSD2的作用相反[4].研究[5]发现：气道上皮组织中存在不同亚型的17β-HSD，可能引发哮喘患者在治疗过程中的激素耐受性，影响患者预后.近年来的研究[6]发现：鼻黏膜组织中也存在17β-HSD1、17β-HSD2表达，但其在人黏膜组织中的生物学作用仍鲜有研究报道.本研究检测了17β-HSD1、17β-HSD2在慢性鼻窦炎伴鼻息肉组织中表达水平，探讨其与激素反应的相关性，旨在为慢性鼻窦炎伴鼻息肉患者糖皮质激素治疗提供激素敏感性评价指标.

1 对象与方法

1.1 研究对象

收集2018年1月—2019年3月上海交通大学医学院附属第九人民医院收治的慢性鼻窦炎伴鼻息肉患者86例，其中，男38例，女48例；年龄31～49岁，平均(36.18±6.30)岁.患者口服醋酸泼尼松0.5 mg/(kg·d)治疗1周，于治疗前后进行内镜鼻息肉评分，息肉仅在中鼻道赋1分，息肉已经超过中鼻甲的下缘赋2分，息肉前端至下鼻甲下缘赋3分，息肉完全堵塞鼻道赋4分.根据治疗后评分下降水平分为激素敏感组(下降幅度≥1分，50例)、激素不敏感组(下降幅度<1分，36例).本研究经医院伦理委员会审核批准，患者自愿参与并签署知情同意书.

入选标准：符合中华医学会2012年颁布的《慢性鼻-鼻窦炎诊治指南中对慢性鼻窦炎伴鼻息肉的诊断标准》[7]；入院前7 d无肾上腺皮质激素、抗组胺类药物使用史；行择期手术，术中留取鼻息肉黏膜组织.

排除标准：有过敏性鼻炎、变应性哮喘史的患者；肝、肾等重要器官功能严重不全者.

1.2 标本与主要试剂

治疗前采集患者部分鼻息肉组织，用生理盐水冲洗后置于-80 ℃冰箱中保存待测.Trizol试剂盒、RT-PCR试剂盒(上海恪敏生物科技有限公司)；RIPA全蛋白提取试剂盒(北京百奥莱博科技有限公司)；鼠抗人17β-HSD1、17β-HSD2单克隆抗体、山羊抗鼠IgG(上海晅科生物科技有限公司).

1.3 方 法

1.3.1 免疫组化检测

取鼻息肉组织，常规制作4 μm石蜡病理切片.60 ℃烤片30 min，二甲苯脱蜡，梯度酒精脱水，高温修复组织抗原，冷却至常温，加内源性过氧化物酶抑制剂，磷酸缓冲液洗涤后滴加鼠抗人17β-HSD1单克隆抗体(1∶500)、鼠抗人17β-HSD2单克隆抗体(1∶500)，4 ℃孵育过夜，滴加山羊抗鼠IgG(1∶2 000)，静置2 h，DAB显色，苏木素复染，中性树胶封片.倒置显微镜下随机选取5个视野，观察染色强度和阳性细胞数.

1.3.2 RT-PCR检测

Trizol法提取鼻息肉组织总RNA，反转录得到cDNA.17β-HSD1、17β-HSD2、β-actin引物序列由上海仁捷生物科技有限公司设计合成.17β-HSD1上游5′-CCAGT ATCGACAAAGGAC-3′，下游5′-TGACCGGCAGCAAAATGT-3′；17β-HSD2上游5′-AGGACACACTTTAACAATA-3′，下游5′-CAGCACT GACCCTT TTGGGA-3′；内参β-actin上游5′-GGAG ACTGTGTACGTCGAGGGCC-3′，下游5′-GTGGTTT GCACCGAACGGTCGGG-3′.反应条件：94 ℃ 5 min，94 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，共40个循环，延伸72 ℃ 30 s.扩增产物行2%琼脂糖凝胶电泳，计算17β-HSD1、17β-HSD2 mRNA相对表达量.

1.3.3 Western blot检测

提取鼻息肉组织全蛋白，4 ℃ 12 000 r/min离心收集上清，BCA蛋白定量，行SDS-PAGE凝胶电泳，转膜至PVDF，5%脱脂奶粉封闭2 h，滴加鼠抗人17β-HSD1单克隆抗体(1∶500)、鼠抗人17β-HSD2单克隆抗体(1∶500)、鼠抗人β-actin单克隆抗体(1∶1 000稀释)，4 ℃过夜，滴加HRP标记的鼠抗人IgG(1∶2 000)稀释，室温静置2 h，ECL显色，在暗室中显影，然后采集图像并分析各条带灰度值.

1.4 统计学分析

2 结 果

2.1 两组患者人口学特征及临床指标

激素敏感组患者合并变应性鼻炎比例、合并哮喘比例明显高于激素不敏感组患者，差异具有统计学意义(P<0.05)；激素敏感组患者治疗后内镜息肉评分明显低于激素不敏感组，嗜酸粒细胞百分比、嗜酸粒细胞绝对值明显高于激素不敏感组，差异具有统计学意义(P<0.05)；年龄、性别、吸烟比例、视觉模拟评分法(VAS)评分、中性粒细胞绝对值在两组患者间比较差异无统计学意义(P>0.05).见表1.

表1 两组患者人口学特征及临床指标

2.2 17β-HSD1、17β-HSD2在鼻息肉组织中的表达分析

免疫组化染色显示：17β-HSD1、17β-HSD2阳性表达呈黄色或棕黄色颗粒，主要表达于鼻息肉组织中的鼻黏膜上皮层，激素敏感组17β-HSD1阳性细胞数和染色强度明显高于激素不敏感组，激素敏感组17β-HSD2阳性细胞数和染色强度明显低于激素不敏感组.见图1.激素敏感组17β-HSD1 mRNA和蛋白表达水平明显高于激素不敏感组，17β-HSD2 mRNA和蛋白表达水平明显低于激素不敏感组，差异具有统计学意义(P<0.05).见图2、表2.

2.3 17β-HSD1，17β-HSD2评估患者激素敏感性的ROC曲线分析

17β-HSD1 mRNA表达预测患者激素敏感性的最佳截断值为4.21，敏感度为26.91%，特异性为95.19%；17β-HSD2 mRNA的最佳截断值为3.63，敏感度为57.35%，特异性为95.15%；17β-HSD1/17β-HSD2的最佳截断值为1.25，敏感度为95.80%，特异性为90.73%.17β-HSD1/17β-HSD2比值预测患者激素敏感性的AUC值明显高于单独17β-HSD1、17β-HSD2的AUC值，也明显高于外周血嗜酸粒细胞百分比、嗜酸粒细胞绝对值的AUC值.见表3.

表2 两组17β-HSD1、17β-HSD2 mRNA和蛋白相对表达量

组别n17β-HSD117β-HSD2mRNA蛋白mRNA蛋白激素敏感组506.48±0.727.31±0.942.41±0.463.79±0.85激素不敏感组363.15±0.544.63±0.867.55±0.898.84±1.07t14.58110.95319.03518.617P0.0100.0090.0010.001

表3 17β-HSD1、17β-HSD2评估患者激素敏感性的ROC曲线分析

3 讨 论

激素是临床治疗鼻息肉的一线药物，但对不同类型慢性鼻窦炎伴鼻息肉患者的疗程存在较大差异[8]，目前仍缺少鼻息肉对激素敏感性的有效预测指标，且治疗过程中对激素敏感性下降的机制仍未明确[9].研究[10]发现：在慢性阻塞性肺疾病、慢性鼻窦炎、哮喘等患者中均存在激素敏感性降低的现象，是预后不良的主要原因之一.相关研究[11]显示：17β-HSD主要表达于细胞内质网中，是一种通过催化氧化还原反应调控类固醇激素合成的活性酶，能够影响细胞中激素含量与活性.有研究[12]提出，在人气道上皮细胞中，内源性激素具有限制合成激素的活性，而细胞17β-HSD能够调节局部内源性激素含量，可能导致慢性鼻窦炎伴鼻息肉患者激素不敏感.本研究显示：17β-HSD1、17β-HSD2两种亚型主要表达于慢性鼻窦炎伴鼻息肉的鼻黏膜上皮层，且激素敏感组17β-HSD1 mRNA和蛋白表达水平明显高于激素不敏感组，17β-HSD2 mRNA和蛋白表达水平明显低于激素不敏感组；ROC曲线分析显示，17β-HSD1/17β-HSD2比值预测患者激素敏感性的AUC值明显高于17β-HSD1、17β-HSD2单独预测以及外周血嗜酸粒细胞百分比、嗜酸粒细胞绝对值的AUC值.提示17β-HSD1/17β-HSD2比值能够较为准确地预测慢性鼻窦炎伴鼻息肉患者激素敏感性和疗效.

近年来研究[13]发现：17β-HSD在调节细胞中活性激素的作用同时也参与人体代谢和抗炎反应，并受局部炎性状态的影响.相关研究[14]显示：人体炎性状态下，17β-HSD1/17β-HSD2平衡失调会降低相关活性因子的抗炎效果；在大鼠结肠炎黏膜中17β-HSD1表达明显提升，17β-HSD2表达明显下降[15]；类风湿性关节炎患者病灶处囊液中17β-HSD1表达水平明显提升[16].亦有研究[17]发现：大环内酯类抗菌药物能够明显上调鼻黏膜上皮细胞中17β-HSD1表达，提升鼻黏膜激素水平；肥大细胞中存在17β-HSD1表达，且能够成为抗感染治疗的作用靶点.上述研究提示17β-HSD1、17β-HSD2表达可能通过调节机体炎症状态来影响激素治疗效果.本研究发现：17β-HSD1/17β-HSD2比值能够较好地预测慢性鼻窦炎伴鼻息肉患者的激素治疗效果，但未进一步探讨相关机制.在后续研究中应继续分析不同炎性状态对17β-HSD的影响及分子机制，为解决慢性鼻窦炎伴鼻息肉治疗中激素不敏感提供理论依据.