4种虫生真菌对朱红毛斑蛾幼虫的室内毒力测定

陈学敏，王小云，陆温，郑霞林

（广西农业环境与农产品安全重点实验室/广西大学农学院 南宁市 530004）

虫生真菌是一类寄生真菌，通过侵染进入昆虫体内，并吸收昆虫营养最终导致寄主死亡。其与化学杀虫剂的作用方式不同，对环境和人体安全，常用于害虫的生物防治[1]。目前，我国已报道的虫生真菌种类超过400 种，其中绿僵菌Metarhiziumspp.和白僵菌Beauveriaspp.商业化推广和应用最为广泛，并在农林害虫的管理方面发挥了重要作用[2]。例如，20 世纪80 年代我国广东省就已应用白僵菌控制马尾松毛虫Dendrolimus punctatus（Walker），防效达到80%，经过多年治理其为害面积从6.667×105ha 降至2×104ha，是我国通过虫生真菌控制林业害虫最成功的案例之一[3]。然而，不同虫生真菌对同一寄主的毒力存在差异，蔡守平等[4]利用4 株球孢白僵菌BbAX-02、BbAX-04、BbFZ-11 和BbHA-01，对马尾松毛虫4、5 龄幼虫进行毒力测定时，BbAX-02 和BbAX-04 的校正死亡率分别达到了100%和92.5%，而BbFZ-11 和BbHA-01则仅为27.5%和30%；同一虫生真菌对不同寄主的毒力也存在一定差异，测定了9株白僵菌对小菜蛾Plutella xylostella（Linnaeus）2 龄幼虫和烟粉虱Bemisia tabaci（Gennadius）2 龄若虫的毒力，结果显示有6株在2种寄主之间表现出显著差异[5]。因此筛选高毒力虫生真菌有利于提高靶标害虫的防治效果。

朱红毛斑蛾Phauda flammans（Walker）（鳞翅目Lepidoptera 毛斑蛾科Phaudidae 毛斑蛾属Phauda）是榕属Ficusspp.植物上的重要食叶害虫，偏好小叶榕F.microcarpa（Miq.）和垂叶榕F.benjamina（L.）[6]。在我国，朱红毛斑蛾主要发生在广东、广西、云南、海南及福建等南方省份[7-8]。成虫主要产卵在树梢顶端当年生嫩叶或叶柄上[9]，幼虫从树冠顶层叶片开始取食，使榕树出现“秃顶”现象，严重时整株叶片被食光仅剩树枝，不仅影响榕树的生长发育，还影响景观效果和生态效应[10]。目前，针对该虫的管理仍以化学防治为主[11]，但朱红毛斑蛾的为害多发生在市区道路和公园等人群密集区，施用化学杀虫剂不仅污染环境，还威胁周边群众的身体健康，因此急需找到安全有效的防治手段。研究虫生真菌对朱红毛斑蛾幼虫的致病力，可为探索朱红毛斑蛾的绿色防治提供参考资料。

本研究通过比较1株分离自朱红毛斑蛾幼虫僵虫的球孢白僵菌PfBb 与3 种常用虫生真菌（金龟子绿僵菌Mafz01、卵孢白僵菌400、球孢白僵菌DSXJ-07）对朱红毛斑蛾幼虫的毒力，以期明确球孢白僵菌PfBb 的致病力，为利用虫生真菌防治朱红毛斑蛾奠定基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 供试菌株

球孢白僵菌PfBb（课题组自备）、金龟子绿僵菌Mafz01、卵孢白僵菌400和球孢白僵菌DSXJ-07（江苏盐城神微微生物菌种科技有限公司，盐城，中国）。

1.1.2 供试昆虫

采集广西大学校园内（22°83’N，108°29’E）为害垂叶榕的朱红毛斑蛾幼虫，带回室内后根据其头壳宽度选择4龄健康幼虫作为试虫[10]。将试虫放入用75%酒精消毒后的塑料盒（半径为4 cm，高度为15 cm）内，10头/盒，在温度25±1℃、光照L16：D8 和pH 值75% ± 5%的条件下饲养。每天更换1次新鲜垂叶榕叶片作为食料。

1.2 试验方法

将金龟子绿僵菌Mafz01、卵孢白僵菌400、球孢白僵菌DSXJ-07 和球孢白僵菌PfBb 用0.05%吐温-80 溶液配分别制成1.0×109、1.0×108、1.0×107、1.0×106和1.0×105孢子/mL 共5 个浓度处理，以0.05%吐温-80 溶液为对照。采用浸虫法，将试虫浸入不同浓度的孢子液5 s后取出，用吸水纸吸去体表多余液体后置于塑料盒中饲养。每个处理重复4 次，每个重复处理20 头幼虫。连续观察10 d，每天8：00、16：00 和23：00 定时检查朱红毛斑蛾幼虫死亡情况。发现幼虫死亡则将其移出培养皿，并置于另一个经过75%酒精消毒的培养皿内保湿培养，观察其虫体是否长出菌丝，记录僵虫数，计算校正死亡率和僵虫率。计算公式如下。

校正死亡率（%）= ［（处理组死亡率-对照组死亡率）/（1-对照组死亡率）］×100

僵虫率（%）=（某处理感染球孢白僵菌的僵虫数/某处理总虫数）×100

1.3 数据统计与分析

采用SPSS 19.0 软件（IBM Corp., Armonk,New York, USA）进行数据统计分析，通过Probit回归（概率单位回归）分析计算毒力回归方程、LC50及95%置信区间；僵虫率采用Tukey’s-HSD进行单因素方差分析（P＜0.05）。采用GraphPad Prism 5 对生存曲线进行对数秩检验（Log-rank Test）及制图。

2 结果与分析

2.1 4种虫生真菌对朱红毛斑蛾幼虫的毒力

金龟子绿僵菌Mafz01、卵孢白僵菌400、球孢白僵菌DSXJ-07 和球孢白僵菌PfBb 的不同孢子浓度处理朱红毛斑蛾幼虫后1～3 d的校正死亡率均较低，处理4～7 d 校正死亡率呈上升趋势，处理8 d后校正死亡率基本维持在一定水平。

4种虫生真菌不同浓度处理后，朱红毛斑蛾幼虫的校正死亡率存在差异（图1）。不同浓度处理中，用球孢白僵菌PfBb 处理10 d 的校正死亡率均为最高，处理浓度为1.0×105、1.0×106、1.0×107、1.0×108和1.0×109孢子/mL 的校正死亡率分别为37.33%、62.67%、97.33%、100%和100%，通过对数秩检验发现，球孢白僵菌PfBb 处理的朱红毛斑蛾幼虫校正死亡率显著高于相同浓度处理的其他3 种虫生 真菌（105：x2= 22.12，df= 3，P＜0.05；106：x2=23.61，df=3，P＜0.05；107：x2=55.92，df= 3，P＜0.05；108：x2= 36.30，df= 3，P＜0.05；109：x2= 42.19，df= 3，P＜0.05）。然而，当浓度为1.0×105、1.0×106和1.0×107孢子/mL时，金龟子绿僵菌Mafz01、卵孢白僵菌400 和球孢白僵菌DSXJ-07 三者间差异不显著（105：x2=0.02，df= 2，P= 0.9885；106：x2= 4.4，df= 2，P=0.1105；107：x2=0.97，df=2，P=0.6171）。

图1 4种虫生真菌对朱红毛斑蛾幼虫存活率的影响

处理时间相同时，4种虫生真菌的LC50有所不同（表1）。处理时间为8 d 时，金龟子绿僵菌Mafz01 的LC50最高为3.1×108孢子/mL，球孢白僵菌PfBb的LC50最低为2.8×105孢子/mL。4种虫生真菌对朱红毛斑蛾幼虫的毒力由大至小为球孢白僵菌PfBb＞球孢白僵菌DSXJ-07＞卵孢白僵菌400＞金龟子绿僵菌Mafz01。

表1 4种虫生真菌对朱红毛斑蛾幼虫的毒力

2.2 不同虫生真菌处理后朱红毛斑蛾幼虫僵虫率

孢子浓度相同时，不同虫生真菌处理后的朱红毛斑蛾幼虫僵虫率差异显著（105：F=72.440，df= 3，12，P＜0.05；106：F= 52.534，df= 3，12，P＜0.05；107：F= 125.806，df= 3，12，P＜0.05；108：F= 120.174，df= 3，12，P＜0.05；109：F= 56.048，df= 3，12，P＜0.05）（表2）。同种虫生真菌不同孢子浓度处理后的朱红毛斑蛾幼虫僵虫率差异显著（金龟子绿僵菌Mafz01：F=37.286，df= 4，15，P＜0.05；卵孢白僵菌400：F= 62.406，df= 4，15，P＜0.05；球孢白僵菌DSXJ-07：F= 111.239，df= 4，15，P＜0.05；球孢 白 僵 菌PfBb：F=124.339，df= 4，15，P＜0.05）（表2）。球孢白僵菌PfBb在各浓度下侵染造成的朱红毛斑蛾幼虫僵虫率显著高于金龟子绿僵菌Mafz01、卵孢白僵菌400 和球孢白僵菌DSXJ-07。在1.0×105、1.0×106和1.0×107孢子/mL 浓度下，金龟子绿僵菌Mafz01、卵孢白僵菌400 和球孢白僵菌DSXJ-07三者的僵虫率差异不显著。

表2 不同虫生真菌处理后的朱红毛斑蛾幼虫僵虫率

3 结论与讨论

不同种类的虫生真菌对同一寄主的致病力往往存在着差异，并且分离自第一寄主的虫生真菌对该寄主的致病力一般高于分离自其他寄主的虫生真菌，即虫生真菌存在一定的寄主选择性[12]。本研究对1株分离自朱红毛斑蛾幼虫僵虫的球孢白僵菌PfBb，同市面上出售的3 种虫生真菌（金龟子绿僵菌Mafz01、卵孢白僵菌400 和球孢白僵菌DSXJ-07）进行了致病力的比较研究，结果显示不同虫生真菌对朱红毛斑蛾幼虫的致病力存在差异，其中球孢白僵菌PfBb 对幼虫的致病力最高。周建云等[13]比较了多种球孢白僵菌菌株对烟青虫Heliothis assulta（Guenée）的毒力，发现自烟青虫上分离得到的球孢白僵菌Bb062 的累积校正死亡率最高，达到91.07%±4.61%，致病力显著高于分离自棉叶蝉Empoasca biguttula（Ishida）的球孢白僵菌Bb908等其他菌株。由于僵虫率越高，虫生真菌二次传播的可能性越高，因此僵虫率也是评价虫生真菌致病力的一个重要指标[14]。赵俊芳等[15]比较了4 株球孢白僵菌对柳膜肩网蝽Hegesidemus habrus（Drake）的致病力，结果显示球孢白僵菌BF 处理后柳膜肩网蝽的死亡率为91.11%±10.18%，僵虫率为84.44%±15.40%，而球孢白僵菌TST 处理后柳膜肩网蝽的死亡率为70.00%±14.53%，僵虫率为44.44%±13.47%，表明虫生真菌只有成功侵染并导致寄主死亡才能在虫体上繁殖产生分生孢子，因此死亡率越高，僵虫率也较高。

虫生真菌对昆虫具有寄主选择性的原因目前尚不明确，但对虫生真菌侵入虫体过程的相关研究表明许多因素可能影响其寄主选择性，包括孢子吸附、孢子萌发、侵入及其进一步的生长等[16]。本研究结果表明，球孢白僵菌PfBb 对朱红毛斑蛾幼虫的致病力显著高于金龟子绿僵菌Mafz01、卵孢白僵菌400和球孢白僵菌DSXJ-07，表现出一定的寄主选择性。通常情况下，致病力较低的虫生真菌其分生孢子在寄主体表附着率低。例如，Altre 等[17]比较了8 株玫烟色棒束孢Isaria fumosorosea（Wize）对小菜蛾的致病力差异，发现致病力较低的菌株ARSEF1576 的孢子附着率低，推测球孢白僵菌PfBb 在朱红毛斑蛾幼虫体表具有较高的孢子萌发率。虫生真菌的芽管穿透寄主体壁是侵染的重要环节，球孢白僵菌PfBb 对朱红毛斑蛾幼虫具有较高的致病力可能是其芽管比金龟子绿僵菌Mafz01、卵孢白僵菌400和球孢白僵菌DSXJ-07有更强的穿透能力。例如，周哲宇等[5]比较了两株球孢白僵菌Bb104和Bb120的致病力，结果表明2株球孢白僵菌Bb104和Bb120对烟粉虱和小菜蛾的致病力均存在显著差异，并观察到两株球孢白僵菌的芽管在昆虫体表的伸长速度存在差异，认为芽管能否突破寄主体壁影响了虫生真菌对不同寄主的致病力。此外，分生孢子在侵入过程中会产生酶类物质帮助芽管侵入寄主体壁，如孢外蛋白酶和几丁质酶等，研究表明孢外酶活力与虫生真菌的毒力呈正相关关系[18]，但也有报道显示孢外酶活力与虫生真菌致病力无关。例如，曹伟平等[19]探究了4 株球孢白僵菌菌株胞外酶活力和毒力的关系，结果显示酶活性最高的菌株HFW-05对小菜蛾的毒力高，而对棉铃虫的毒力低。但胞外酶活力与金龟子绿僵菌Mafz01、卵孢白僵菌400、球孢白僵菌DSXJ-07 和球孢白僵菌PfBb 致病力间的关系尚不明确。因此，不同虫生真菌对朱红毛斑蛾幼虫致病力差异的原因，还需要进一步开展不同虫生真菌在寄主体表萌发率、芽管发育情况以及胞外酶活力等方面的研究。

针对朱红毛斑蛾幼虫的防治，推荐使用浓度大于1.0×107孢子/mL 的球孢白僵菌PfBb，能取得较好的防治效果。但在自然条件下的防治效果尚需进一步研究。