自体富血小板血浆对骨关节炎模型兔软骨细胞凋亡及NLRP3/IL-1β通路的影响*

屈一鸣，邵高海，张铭华，李 波，朱凤臣，何 超，曹春风，赵 波

（重庆医科大学附属永川医院骨科，重庆402160）

膝骨关节炎属于常见骨关节疾病，伴随炎症、疼痛、骨组织病变、关节功能丧失，随着老龄化的升高发病率逐渐升高，使膝关节功能降低，影响患者生活质量[1]。目前临床治疗骨关节炎的方法较多，但关节自身再生能力较差，目前尚无理想治疗方法，因此促进损伤软骨的修复及进行干预、预防对于提高患者预后十分重要。富血小板血浆（platelet-rich plasma，PRP）是自体血液中分离的血液制品，其含有的高浓度血小板可释放出大量的生长因子，促进软骨的修复，多项研究证实其能够促进软骨组织再生及修复[2-3]。核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白3（nucleotide-binding oligomerization domain-like receptor protein 3，NLRP3）在固有免疫中发挥重要作用，近期研究显示NLRP3信号通路的异常激活与骨关节炎的发生密切相关[4]，然而其是否参与PRP修复骨关节炎受损软骨过程目前尚不清楚。本研究复制兔骨关节炎模型并给予PRP治疗，旨在探究其对受损软骨的修复作用及可能的作用机制。

材料和方法

1 实验动物

SPF级雄性新西兰大白兔27只，体重1.8～2.0 kg，由重庆医科大学实验动物中心提供，实验动物生产及使用许可证号为SCXK（渝）2018-0003，动物质量合格证号为2019012704，饲养温度控制在22～25℃，湿度为50%，饲养1周后用于实验。

2 主要药品、试剂与仪器

玻璃酸钠（sodium hyaluronate，SH）注射液购于山东博士伦福瑞达制药有限公司；苏木素-伊红染色试剂盒购于中杉金桥生物公司；免疫组化检测试剂盒购于北京索莱宝有限公司；RIPA裂解液、BCA检测试剂盒和TUNEL染色试剂盒购于碧云天生物技术有限公司；脱钙液购于BOSTER；兔抗鼠NLRP3、caspase-1、含caspase募集结构域的凋亡相关斑点样蛋白（apoptosis-associated speck-like protein containing a caspase recruitment domain，ASC）和白细胞介素1β（interleukin-1β，IL-1β）抗体购于Abcam；兔抗鼠caspase-3、Bax、β-actin和Bcl-2抗体及HRP标记的Ⅱ抗购于Sigma。NLRP3抑制剂MCC950和IL-1β抑制剂eucalyptol购自MCE；NLRP3和IL-1β ELISA试剂盒购自上海恒斐生物科技有限公司。

RM2135型石蜡切片机购于TKO；BX53型光学显微镜购于Olympus；Gel Doc XR型凝胶成像仪购于Bio-Rad；OmniPAGE Maxi型垂直电泳仪购于Cleave。

3 实验方法

3.1 PRP的制备 根据Freymiller等[5]的方法制备PRP：采集兔耳静脉血10 mL，200×g离心10 min后，收集白层膜以上血浆，置于离心机中，800×g离心10 min，下层0.8 mL为PRP，吹打均匀，细胞数为（1.98±0.33）×109/L。

3.2 模型制备和分组 随机选择6只兔作为假手术（sham）组，剩余21只兔用于模型制备。采取改良Hulth法[6]制备左膝骨关节炎模型：于关节正中部位做一切口，长为4 cm，将关节腔逐层打开后，探查关节腔内是否存在病变，将前交叉部位韧带、内侧副韧带切断，并切除内侧半月板，止血后用生理盐水冲洗腔内，逐层缝合切口。造模后第1天经肌肉注射青霉素预防感染，注射量为3×105U/kg，连续注射1周，隔天换药至伤口愈合，观察到兔出现关节肿胀、活动度降低、皮温升高的特征，则代表模型成功，6周后停止造模。假手术组仅切开膝关节皮肤，不做其他处理。造模成功18只，将造模成功的兔随机分为模型（model）组、SH组和PRP组，每组6只。SH组于左膝关节腔注射0.5 mL SH注射液，每周1次；PRP组于左膝关节腔注射0.5 mL PRP，每次1次；sham组和model组均注射等量生理盐水，连续5周。

3.3 样本采集及软骨细胞的分离和培养 末次给药结束后，兔禁食、禁水12 h，采用空气栓塞法处死兔，立刻用手术刀截取模型组兔约1 mm×1 mm×1 mm胫骨近端软骨面，置于DMEM培养液中，除去血污，青、链霉素双抗清洗3次，加入胰酶消化，消化完全后，离心，弃去上清液，随后加入0.025%Ⅱ型胶原酶，37℃恒温震荡5 h，离心收集细胞，并用DMEM混悬，培养于含有10%FBS的DMEM培养液中。获取膝关节腔观察关节大体情况；将一部分软骨组织置于10%多聚甲醛中固定24 h，另一部分软骨组织冻存于-80℃。

3.4 软骨大体形态观察 肉眼观察膝关节软骨表面，采取Pelletier评分[7]对软骨大体形态进行评定，根据软骨表面缺损情况、光泽等来评定，评分为0～4分，评分越高表明软骨损伤越严重。

3.5 HE染色评定软骨病理形态学的变化 取出固定的软骨组织，置于脱钙液中处理10 d后，进行石蜡包埋，制备石蜡切片，切片厚度为6 μm，HE染色，参照Mankin评分[8]对软骨组织病理学变化进行评定。

3.6 TUNEL染色观察软骨组织细胞凋亡情况 软骨组织石蜡切片在二甲苯中脱蜡、乙醇中脱水后，添加不含DNase的蛋白酶，PBS洗涤3次后，在样品上加50 μL TUNEL检测液，37℃避光孵育60 min，PBS洗涤3次，采取抗荧光淬灭封片液封片，在荧光显微镜下观察细胞凋亡情况。细胞凋亡率（%）=凋亡细胞数/细胞总数×100%。

3.7 免疫组化检测NLRP3/IL-1β通路蛋白的表达采用SP染色法染色软骨组织切片，切片经脱蜡脱水后置于0.3%过氧化氢中孵育10 min，微波修复后采用血清封闭抗原，采用Ⅰ抗（1∶200）孵育切片，4℃冷藏过夜后，清洗后添加Ⅱ抗室温下孵育1 h，添加链卵白素Ⅱ抗稀释液，经DAB显色、苏木素复染、透明、脱水、封片后，在光镜下观察蛋白染色情况，NLRP3蛋白定位在细胞膜上，ASC、caspase-1和IL-1β定位在细胞质或细胞浆内，用ImageJ软件定量评估蛋白阳性表达率。

3.8 Western blot法检测凋亡相关蛋白表达 软骨组织脱钙处理后，用RIPA裂解液提取组织蛋白，BCA法检测蛋白浓度后，统一量取40 μg进行SDSPAGE，将分离后的蛋白转移至PVDF膜上，5%脱脂奶粉溶液封闭膜后，采用抗caspase-3、Bax、Bcl-2抗体（1∶300）孵育，浓膜用HRP标记的Ⅱ抗孵育，经ECL发光显影后用ImageJ软件定量分析蛋白相对表达。

3.9 NLRP3和IL-1β调控关系的验证 取分离的软骨细胞，用DMEM培养液调整细胞密度为1×108/L，随后接种到24孔板中，培养过夜。设置对照（control）组（不经任何处理）、MCC950（125 μmol/L）组和eucalyptol（500 μmol/L）组，每组设置6个复孔。按照分组处理，继续培养48 h后，用ELISA测定各组细胞NLRP3和IL-1β的水平。

4 统计学处理

采用SPSS 22.0软件进行分析。计量资料以均数±标准差（mean±SD）描述，多组间比较行单因素方差分析，进一步两两比较采用SNK-q检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 自体PRP对兔软骨大体形态的影响

如图1所示，假手术组的膝关节大体色泽明亮，关节表面平整，软骨厚度正常，未发生退变；模型组的兔软骨表面不平整，关节失去正常光泽，软骨组织呈片状剥落，见图中虚线部位；经SH或PRP治疗后软骨组织得到一定的修复，其中PRP组的改善优于SH组。

Figure 1.General condition of the rabbit cartilage in each group.图1 各组兔软骨大体情况

与假手术组相比，模型组的Pelletier评分显著升高（P＜0.05）；与模型组相比，SH组和PRP组的Pelletier评分显著降低（P＜0.05），且PRP组的Pelletier评分低于SH组（P＜0.05），见表1。

2 自体PRP对兔软骨组织形态的影响

假手术组的软骨细胞排列整齐、潮线完整清晰，基质染色均匀；模型组的软骨组织不清晰，软骨层变薄，细胞紊乱排列，数量减少，潮线模糊；经SH或PRP治疗后软骨细胞数量增多，软骨组织、细胞形态接近正常，见图2。

与假手术组相比，模型组的Mankin评分显著升高（P＜0.05）；与模型组相比，SH 组和 PRP组的Mankin评分显著降低（P＜0.05），且PRP组的Mankin评分低于SH组（P＜0.05），见表1。

3 自体PRP对骨关节炎模型兔软骨细胞凋亡的影响

与假手术组相比，模型组的细胞凋亡率显著升高（P＜0.05）；与模型组相比，SH组和PRP组的细胞凋亡率显著降低（P＜0.05），且PRP组的细胞凋亡率低于SH组（P＜0.05），见图3、表1。

4 自体PRP对兔软骨组织NLRP3/IL-1β通路相关蛋白表达的影响

Figure 2.HE staining was used to observe the pathomorphological changes of cartilage in rabbits（×200）.图2 HE染色观察兔软骨组织病理形态学变化

与假手术组相比，模型组NLRP3、ASC、caspase-1和IL-1β的蛋白阳性表达率显著升高（P＜0.05）；与模型组相比，SH和PRP组的NLRP3、ASC、caspase-1和IL-1β蛋白阳性表达率显著降低（P＜0.05），且PRP组NLRP3、ASC、caspase-1和IL-1β的蛋白阳性表达率低于SH组（P＜0.05），见图4、表2。

Figure 3.The apoptosis of rabbit chondrocytes observed by TUNEL staining（×200）.图3 TUNEL染色观察兔软骨细胞凋亡情况

表1 各组兔软骨Pelletier评分、Mankin评分和软骨细胞凋亡率的比较Table 1.Comparison of Pelletier scores，Mankin scores and chondrocyte apoptotic rates in the rabbits with different treatments（Mean±SD.n=6）

5 自体PRP对兔软骨组织凋亡相关蛋白表达的影响

以阴性对照组为参考，定量描述各组蛋白表达水平，与假手术组相比，模型组的caspase-3和Bax蛋白表达显著升高（P＜0.05），Bcl-2蛋白的表达显著降低（P＜0.05）；与模型组相比，SH和PRP组的caspase-3和Bax蛋白表达显著降低（P＜0.05），Bcl-2蛋白的表达显著升高（P＜0.05），且PRP组的 caspase-3和Bax蛋白表达低于SH组（P＜0.05），Bcl-2蛋白表达高于SH组（P＜0.05），见图5、表3。

6 NLRP3调控IL-1β的水平

Figure 4.The protein expression of NLRP3，ASC，caspase-1 and IL-1β in the cartilage tissues detected by immunohistochemical staining（×200）.图4 免疫组化法检测软骨组织中NLRP3、ASC、caspase-1和IL-1β蛋白表达

表2 各组NLRP3、ASC、caspase-1和IL-1β蛋白的表达Table 2.The protein expression of NLRP3，ASC，caspase-1 and IL-1β in each group（Mean±SD.n=6）

Figure 5.The protein expression of caspase-3，Bax and Bcl-2 in cartilage tissues detected by Western blot.图5 Western blot法检测软骨组织中caspase-3、Bax和Bcl-2蛋白表达

细胞实验中，与对照组相比，MCC950组NLRP3和 IL-1β的水平显著降低（P＜0.05），eucalyptol组NLRP3的水平无明显变化（P＞0.05），IL-1β的水平则显著降低（P＜0.05），见表4。

讨 论

骨关节炎属于慢性退行关节疾病，病理特征主要为关节软骨变性、软骨下骨硬化等，临床表现为关节疼痛、活动受限等，病情严重者造成残疾[9-10]。本研究采取改良Hulth法切除兔膝关节前交叉韧带、内侧半月板等造成关节力学失稳，引发膝骨关节炎，这一过程与临床骨关节炎机理相似，结果显示模型组兔软骨表面不平整，关节失去正常光泽，软骨组织呈片状剥落，Pelletier评分显著高于假手术组，病理检测发现软骨层变薄，细胞紊乱排列，数量减少，潮线模糊，Mankin评分显著高于假手术组，表明兔软骨组织受到损伤，与以往膝关节动物模型制备结果相似[11]，提示兔骨关节炎模型制备成功。

PRP是从自身血液中分离的含高浓度血小板的血液制品，其能够促进损伤软骨修复，在临床上的应用逐渐开展起来。研究发现膝骨关节炎患者经PRP治疗能够明显改善膝关节功能，减轻患者疼痛，其治疗有效率明显优于SH[12]。动物研究显示骨关节炎兔经关节腔内注射PRP能够明显提高软骨细胞数量，促进软骨修复[13]。本研究发现骨关节炎兔经SH和PRP治疗后软骨组织得到一定的修复，且Pelletier评分和Mankin评分明显降低，PRP组Pelletier评分和Mankin评分显著低于SH组，提示PRP能够缓解骨关节炎软骨损伤，促进软骨修复，效果优于SH，然而其具体机制尚不清楚。

表3 各组caspase-3、Bax和Bcl-2蛋白的水平Table 3.The protein levels of caspase-3，Bax and Bcl-2 in each group determined by Western blot（Mean±SD.n=6）

表4 各组NLRP3和IL-1β水平的变化Table 4.The protein levels of NLRP3 and IL-1β in each group（μg/L.Mean±SD.n=6）

NLPR3属于NLRs家族重要成员，当受到危险信号刺激后能够激活NLRP3蛋白，进而招募ASC和caspase-1组装为NLRP3炎性小体，活化IL-1β前体，使其成为成熟IL-1β，分泌至胞外，发挥炎症效应[14]。本研究发现，与对照组相比，MCC950组NLRP3和IL-1β表达降低，eucalyptol组NLRP3表达无明显变化，IL-1β表达显著降低，提示NLPR3调控IL-1β表达，参与炎症反应。过往研究显示NLPR3炎性小体的活化与骨关节炎的发生密切相关[15]。Fioravanti等[16]研究发现在骨关节炎患者血清检测中发现NLPR3和IL-1β水平明显升高，且与关节肿胀度呈正相关。Zhao等[17]研究发现经LPS诱导的软骨细胞中NLPR3、IL-1β蛋白表达明显升高，推测NLPR3炎症小体可能是骨关节炎新的治疗靶点。Sun等[18]研究证明姜黄素通过抑制炎症通路NLRP3激活降低炎症细胞因子表达从而发挥对骨关节炎的保护作用。本研究发现，与假手术组相比，模型组NLRP3、ASC、caspase-1和IL-1β蛋白阳性表达率显著升高；给予SH或PRP治疗后，通路蛋白阳性表达率均降低，且PRP组蛋白阳性表达率低于SH组，推测NLRP3信号通路参与兔骨关节炎的发病过程，且富血小板可能通过抑制NLRP3信号通路的活化，进而发挥对关节炎模型兔关节软骨的保护作用。

细胞凋亡在骨关节炎软骨损伤中起着支配性作用。细胞凋亡处于正常生理进程，然而过度凋亡属于病理性。软骨细胞凋亡过程受到凋亡相关蛋白的控制，例如：Bcl-2属于抗凋亡蛋白，能够抵抗多种因素引发的细胞凋亡；Bax为凋亡诱导因子，与Bcl-2呈拮抗作用，参与细胞凋亡[19]；caspase-3为细胞凋亡的执行者，在接收到细胞凋亡信号刺激后，使其发生裂解活化，进而使细胞程序性凋亡[20]。本研究发现与假手术组相比，模型组软骨组织细胞凋亡率明显升高，而给予PRP干预后细胞凋亡率明显降低；进一步对凋亡相关蛋白检测发现模型组caspase-3、Bax蛋白表达明显升高，Bcl-2蛋白表达明显降低，PRP干预后，细胞caspase-3、Bax蛋白表达明显降低，Bcl-2蛋白表达升高，提示PRP可通过抑制软骨组织细胞凋亡进而缓解软骨组织损伤，发挥对节炎模型兔骨关节软骨的保护作用。

综上所述，PRP能够促进骨关节炎兔受损软骨的修复，其机制可能与抑制NLPR3/IL-1β信号通路并减少软骨细胞凋亡有关。然而PRP仅能缓解软骨组织损伤而不能完全逆转，这可能与作用剂量有关，后续仍需完善设计方案，进一步充分论证PRP对骨关节炎的修复作用。