黑水虻卵胚胎发育过程及在生产上的应用

莫文艳，王凤英，王国霞，胡俊茹，黄燕华*

(1. 广东省农业科学院动物科学研究所，广州 510640；2. 农业农村部华南动物营养与饲料重点实验室，广州 510640；3. 广东省畜禽育种与营养研究重点实验室，广州 510640；4. 广州安芮洁环保科技有限公司，广州 510450)

黑水虻HermetiaillucensL.是双翅目Diptera水虻科Stratiomyidae扁角水虻属Hermetia昆虫，又名亮斑扁角水虻，幼虫在自然界以动物粪便、腐烂的有机物，如腐肉、瓜果蔬菜和植物性垃圾为食，将这些废弃物转化为自身生物量，生产高价值的蛋白质饲料，具有广阔前景(喻国辉等，2014；胡俊茹等，2018)。因其具有繁殖能力强、生长速度快、转化效率高等特点，已成为当前极具开发潜力的资源昆虫(柴志强等，2012；徐齐云等，2014；易昌金等，2018)。目前，对黑水虻幼虫和成虫的生物学特性已有一些研究(常向前等，2017；Tomberlinetal.，2002；Dieneretal.，2009)，但有关其虫卵胚胎发育的研究还未见报道。姬越等对黑水虻人工饲养的适宜温度进行研究，结果表明，黑水虻卵最佳孵化温度为32℃，在此温度下具有最高的孵化率和最短的孵化期(姬越等，2017)。本研究在32℃下观察黑水虻卵的胚胎发育，记录各时期的主要特征，结合虫卵发育的积温法则，死亡虫卵的特征，可以判断虫卵胚胎发育阶段，预估虫卵孵化时间和孵化率，丰富了黑水虻发育学和昆虫生产学的研究内容，同时理论结合实际，为黑水虻卵的人工孵化技术研究提供理论参考。

1 材料和方法

1.1 黑水虻卵胚胎发育过程观察

黑水虻卵取自广州飞禧特生物科技有限公司中试基地成虫棚。幼虫取食餐厨垃圾，饲养温度为30±2℃。成虫的饲养温度为30±3℃，相对湿度为50%～90%，自然光照，白天光照强度为2 000～20 000 Lux。待成虫交配产卵，采集集卵板上的初产卵块置于培养皿内，在光周期L ∶D=14 ∶10，温度为32℃，湿度为80%的人工气候箱中(宁波赛福实验仪器有限公司，PRX-350B)进行培养。每隔0.5 h取出孵化中的胚胎，用显微镜放大50倍(10倍目镜，5倍物镜)观察(卡尔蔡司光学(中国)有限公司，AxioScopeA1)胚胎发育情况，利用AxioVision软件拍照，拍照完毕放回气候箱继续培养。

1.2 黑水虻卵胚胎发育研究在生产上的应用

黑水虻卵聚产，称量0.0100 g初产虫卵，用酒精泡散后计数，得出单克初产虫卵的粒数为40 000～42 000粒，采用1 g卵41 000个卵粒进行后续计算。每一批次虫卵待孵化前，随机取样3份，在分析天平上称取0.0100±0.0050 g虫卵置于载玻片中央，用不锈钢小勺将卵块轻轻推散，用生物显微镜(广州博冠光电科技股份有限公司，605F02)观察记录虫卵发育阶段、虫卵发育整齐度、计算虫卵死亡率后将玻片置于温度为32℃，湿度为80%的气候箱内孵化，虫卵孵化完毕后，数出未孵化的卵数计算孵化率。

孵化率(%)=(100-未孵卵数)/100×100

2 结果与分析

2.1 黑水虻卵胚胎发育过程

黑水虻卵呈长椭圆形，长径955.15±24.75 μm，短径216.90±6.22 μm。刚产出的卵呈乳白色，随着胚胎发育的进行逐渐变为黄色。在32℃环境中，借鉴王进忠等对黏虫胚胎发育各阶段的划分方法和描述(王进忠等，1997)，将黑水虻胚胎发育分为卵裂期、胚盘胚带形成期、原肠形成期、胚体分节期、体壁形成期、器官形成期6个连续时期，历时51 h完成整个胚胎发育过程。详细胚胎发育时序见表1，此发育时序表有助于判断黑水虻存活率以及预测孵化时间。

2.1.1卵裂期(图版A)

黑水虻虫卵的合子核经有丝分裂，形成许多卵裂核，细胞质包裹卵裂核形成合胞体，显微镜下可观察到胚胎中部有大量卵黄颗粒。

2.1.2胚盘胚带形成期(图版B, C, D, E)

胚胎发育4 h，卵裂期形成的活质体在卵周质层排列成多核体层，包围内部卵黄，显微镜内观察到四周有空隙的虫卵形态。胚盘形成后(图B)，卵内腹部胚盘细胞分裂加速，背部形成向初级背器(图C)。胚胎发育5 h，形成胚带，而后下部胚盘内陷形成胚外膜(图D)。胚带形成后，胚胎逐渐向卵内部陷入，至胚胎发育的8.5 h，形成“瓶”状的胚带(图E)，以后瓶上方端发育为胚胎的头部，下端发育为胚胎的腹部。

表1 黑水虻卵胚胎发育时序

图1 黑水虻卵胚胎发育过程Fig.1 The embryonic developmental process of black soldier fly注：卵裂期，A；胚盘胚带形成期，B、C、D、E；原肠形成期，F、G；胚体分节期，H、I；体壁形成期，I、J、K；器官形成期，K、L、M、N、O、P。Note: Cleavage stage, A; blastoderm embryo formation stage, B, C, D, E; primitive intestinal formation stage, F, G; embryo body segmentation stage, H, I; integument formation stage, I, J, K; organ formation stage, K, L, M, N, O, P.

2.1.3原肠形成期(图版F, G)

胚胎发育的11.5 h，出现原肠沟，原肠沟两侧不断向胚体中部扩展，历经2 h，形成不封闭的原肠。原肠形成后，胚体分为两个胚层。贴近胚体腹部的胚层较薄，为单层细胞即外胚层，将来发育成表皮及其衍生物、神经系统、消化道两端等，远离腹部胚层较厚，为细胞群即中胚层，将来发育为真皮、肌肉、性腺组织等。

2.1.4胚体分节期(图版H, I)

胚体发育16.5 h，分化出明显的原头、原躯，外胚层的胚带上出现很多横沟。同时期，胚体前端分节内陷形成口道，胚体后端内陷形成肛道。

2.1.5体壁形成期(图版I, J, K)

胚体发育30 h时，出现淡红色眼点，同时体壁背合开始，胚体后端的外胚层从两侧向上包围卵中部的卵黄，历经5 h，在背面汇合。

2.1.6器官形成期(L, M, N)

消化道发育：胚胎发育28.5 h时，胚体尾端的外胚层内陷形成肛陷，体壁背合过程中，位于原肠两端的内胚层细胞相向发育，形成最终中肠，体壁背合完成后，无法再继续观察消化道的发育情况。神经系统发育：胚体发育35 h，神经系统发育完成，胸部胸神经块明显。循坏系统发育：胚体发育40.5 h，循环系统形成，背血管明显，43.5 h时，可观察到心脏跳动。呼吸系统发育：产卵后44.5 h，气管形成，黑色主气管明显。

2.2 黑水虻卵胚胎发育在生产上的应用

通过镜检技术对每一批次待孵化虫卵进行镜检观察，初步判定该批次待孵化虫卵所处的发育阶段、发育整齐度和虫卵死亡率。发育阶段异常、发育整齐度差或死亡率高于生产要求则进行相应的处理，避免后期孵化过程中造成人力和物力的大量浪费。从虫卵胚胎发育图制定以来，笔者所在项目组每天对虫卵进行镜检，下表2为2018年每月的虫卵镜检情况(均值)。基地在每天18 ∶00采收虫卵，采收的虫卵保存温度为20～30℃，湿度为60%～80%的房间内，早上8 ∶00镜检虫卵。

表2 黑水虻卵镜检数据记录

3 结论与讨论

对于胚胎发育的研究，研究者们通常用固定液将待研究卵固定、经过一系列的处理去掉卵壳后再进行胚胎发育的观察(Tomberlinetal.，2002；李冰杨等，2008；寇利轩，2016)。黑水虻虫卵个体小、卵壳薄、且发育历期较短，各发育阶段典型特征明显，因此本实验对虫卵未进行任何处理，在其自然孵化的条件下进行观察，步骤简单、操作简便，更加切合生产中的实际应用。

黑水虻幼虫属于无足型幼虫，在胚胎发育过程中，未观察到明显胸腹部附肢形成的特征，随着胚体的发育，在产卵后的37.5 h，咀嚼式口器以及触角发育完成。许多昆虫在胚胎发育过程中，胚体为更好的吸收卵黄营养，会发生胚体反转现象(赵欣平等，1990；张群玲等，1998；崔双双等，2011)。黑水虻的胚动无反转现象，只是在胚体上升期时，贴近腹面的胚带尾端向卵内部缩回，胚体变短，而后胚带头端向卵内部移动，在胚体下降期时，胚带头端又回到腹部，而后胚带拉长，胚带尾端慢慢向原来位置缩回。

在对黑水虻卵镜检的过程中，针对出现的异常情况进行分析，寻找原因，可以丰富黑水虻卵孵化机制的研究。对虫卵发育进行持续观察，发现正常幼虫出壳前尾部会分泌一种疑似具有溶解卵壳功能的液体，幼虫通过蠕动身体把部分液体挤到头顶，利用口器持续顶头顶卵壳，直到出现裂缝，幼虫从卵壳中爬出。实际生产中通过镜检发现存在胚胎已发育完全、幼虫在蠕动但未能破壳的现象，可能是因为胚胎发育过程中受到某种应激而导致其破壳不成功，可能是分泌的液体不够，也可能是自身的力量不够，具体原因还需进一步研究。

在实际生产镜检中发现，成虫繁育的温湿度以及虫卵采收后的保存温湿度，对黑水虻卵的发育阶段以及死亡虫卵占比具有影响。笔者所在项目组2018年10月份改进了成虫繁育室的温湿控制系统之后，各月份虫卵死亡占比明显低于2018年1月和2月，虫卵孵化率明显高于2018年1月、2月，这可能是因为1月、2月成虫交配过程中温度偏低会加大未受精卵比率。2018年10月前采收的虫卵保存在室温中，10月后采收的虫卵保存在28～30℃(空调加温)，湿度为60%～80%(加湿器加湿)的房间内，可以看出恒温环境中保存的虫卵发育更加整齐，这可能是因为每批虫卵的产卵间隔偏长(产卵时间12 ∶00-18 ∶00，约6 h)，先产的虫卵发育快，环境温度偏低时，单批卵的发育阶段被慢慢拉开，镜检到的发育阶段为B-D，30℃保存时，镜检的发育阶段为D-E，相对整齐。6月、7月、8月发育整齐度较差可能是因为产卵间隔期更长所致(产卵时间9 ∶00-18 ∶00，约9 h)。

黑水虻虫卵胚胎发育特征明显，使用生物显微镜即可对其发育过程进行观察，所需仪器设备成本低廉，一般的生产企业均有能力购买和应用。虫卵胚胎发育是黑水虻养殖环节中的的第一步也是极为重要的一步，虫卵孵化率、初孵幼虫的活力等参数直接影响后续所有生产流程。后续需继续对黑水虻虫卵的孵化机制进行更深一步的研究。