右美托咪定对大鼠机械通气相关肺损伤时小窝蛋白-1表达的影响

王华 孟志鹏 宋鹏涛 刘静 赵燕

机械通气是急性呼吸窘迫综合征等危重患者呼吸治疗的主要手段，也是全麻患者术中生命安全不可或缺的保障措施；但是机械通气相关肺损伤（ventilator-induced lung injury，VILI）等并发症不可避免[1]。Toll样受体 4（TLR4）/核因子-κB（NF-κB）信号通路介导的炎症反应是VILI发生、发展、转归的核心环节[2]。因此，阻断TLR4/NF-κB信号通路、抗炎是防治VILI的关键。右美托咪定（dexmedetomidine，Dex）是一种新型高选择性α2肾上腺素能受体激动剂，本课题前期研究证明Dex具有特异性抗炎并发挥肺保护的作用[3]，有研究揭示Dex减轻大鼠VILI的机制与不同程度抑制TLR4介导的细胞信号转导通路、减轻肺部炎性反应密不可分[4-5]。研究表明，小窝蛋白-1（caveolin-1，Cav-1）参与机体病理、生理变化，如作用于TLR4信号通路而抑制机体炎性反应[6]，在调控体内炎性反应方面起到不可或缺的作用[7]。本研究旨在观察Cav-1在Dex干预大鼠VILI时表达的变化，进一步明确Dex减轻肺损伤的机制。

1 材料和方法

1.1 动物分组与模型制备 体重225～280g、清洁级成年健康雄性SD大鼠30只，由浙江省医学科学院动物实验中心提供[动物使用许可证号：SYXK（浙）2014-0001]，按照实验动物使用和管理指南进行喂养和处理。恒温环境中适应性饲养1周。按随机数字表法分为3组，每组10只：对照组（C组）、VILI组（V组）、Dex预注射+VILI组（DV组）。实验大鼠自由饮水、禁食12h，股静脉穿刺、置管、建立液体通道，200μg Dex（规格：200μg：2ml，批号：16100932，江苏恒瑞医药股份有限公司）溶解于40ml 0.9%氯化钠注射液中配置成5μg/ml Dex注射液（依据文献[8]选择Dex最佳剂量），DV组大鼠按1ml/kg经股静脉注射Dex注射液，C组、V组注射等量的0.9%氯化钠注射液进行对照；然后DV组按1ml/（kg·h）的速率持续静脉泵注Dex注射液，C组、V组按相同速率持续静脉泵注0.9%氯化钠注射液，直至机械通气期结束。20min后腹腔注射戊巴比妥钠充分麻醉大鼠，然后置于棉垫上，仰卧位固定，备皮、消毒后行气管切开术，插入自制气管导管（静脉穿刺针套管），气管插管成功后C组大鼠保留自主呼吸4h，V组、VD组行机械通气4h，使用小动物专用呼吸机（美国Harvard公司），按文献[9]设置通气频率40次/min、潮气量40ml/kg、吸呼比1:1、吸入气中的氧浓度分数（FiO2）21%，维持呼气末CO2分压在35～45mmHg。4h后采取动脉快速放血法处死大鼠，迅速分离两侧肺组织并完全取出，丝线缝扎右主支气管，灌胃针抽取3ml；4℃0.9%氯化钠溶液灌洗左肺3次，回收全部支气管肺泡灌洗液（BALF），保证回收率达到80%。

1.2 肺损伤定量评价指标（IQA）检测 取大鼠右肺上叶组织，常规4%多聚甲醛固定、包埋、切片、苏木素-伊红（HE）染色。根据文献[10]的方法，在光学显微镜（×200）50个视野下计算损伤的肺泡数目占肺泡总数的比例，即IQA。

1.3 肺组织湿干比（W/D）检测 取大鼠右肺下叶组织，用滤纸立即吸尽其表面附着的残余血液、水分，称其重量为湿重（W）；然后置于70℃烤箱烘烤、脱水48h直至重量不再改变，取出再次称其重量为干重（D）；计算两者比值，即W/D。

1.4 BALF中clara细胞分泌蛋白16（clara cell protein-16，CC-16）及炎症因子浓度检测 采用ELISA法。BALF在低温下离心10min（1 200r/min，离心半径10cm），取上清液。使用试剂盒（美国R&D公司）测定BALF中CC-16、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白细胞介素（IL）-1β、IL-6浓度，严格按照说明书进行操作。

1.5 肺组织Cav-l、TLR4及NF-κB蛋白相对表达量检测 采用链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶（SP）法。取左肺上叶组织，多聚甲醛溶液固定，严格按照SP免疫组化试剂盒（北京中杉金桥公司）说明书进行免疫组化染色。免疫组化反应阳性产物为淡黄色、棕黄色或棕褐色颗粒。每个标本观察2张病理切片，每张切片随机选择5个不同视野，Olympus相机拍照；利用Image-pro plus 6.0图像软件分析每张照片的累积吸光度值和面积，计算5个视野的平均吸光度值。平均吸光度值=累积吸光度值/面积，即目的蛋白相对表达量。

1.6 肺组织Cav-l、TLR4、NF-κB mRNA相对表达量检测 采用逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）法。液氮研磨肺组织后，Trizol法提取总RNA，肺组织中RNA浓度用紫外分光光度计测定。采用两步法RT-PCR试剂盒进行扩增反应，将RNA逆转录成cDNA，严格按照试剂盒说明进行操作，引物序列见表1。采用25μl反应体系，扩增条件：95℃预变性 5min；95℃ 1min，56℃40s，72℃40s，循环 40次；72℃延伸 10min；4℃保存。使用 RTPCR仪（Light Cyeler 480，美国Roche公司）检测各样本的域值循环数（CT）值，利用△CT法计算目的基因mRNA相对表达量。

表1 目的基因引物序列

1.7 统计学处理 应用SPSS 19.0统计软件。计量资料用表示，多组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用SNK-q检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 3组大鼠IQA及W/D比较 与C组比较，V组、

DV组IQA、W/D均明显升高（均P＜0.05）；与V组比较，

DV组IQA、W/D均明显下降（均P＜0.05），见表2。

表2 3组大鼠IQA及W/D比较

2.2 3 组大鼠 BALF 中 CC-16、TNF-α、IL-1β、IL-6 浓度比较 与C组比较，V组、DV组CC-16、TNF-α、IL-1β、IL-6浓度均明显升高（均 P＜0.05）；与 V 组比较，DV组 CC-16、TNF-α、IL-1β、IL-6 均明显下降（均 P＜0.05），见表3。

2.3 3组大鼠肺组织Cav-1、TLR4、NF-κB蛋白相对表达量比较 与C组比较，V组、DV组Cav-1蛋白相对表达量均明显降低，TLR4、NF-κB蛋白相对表达量均明显升高，差异均有统计学意义（均P＜0.05）；与V组比较，DV组Cav-1蛋白相对表达量明显升高，TLR4、NF-κB蛋白相对表达量均明显降低，差异均有统计学意义（均 P＜0.05），见表 4。

2.4 3组大鼠肺组织 Cav-1、TLR4、NF-κB mRNA 相对表达量比较 与C组比较，V组、DV组Cav-1 mRNA相对表达量均明显降低，TLR4、NF-κB mRNA相对表达量均明显升高，差异均有统计学意义（均P＜0.05）；与V组比较，DV组Cav-1 mRNA相对表达量明显升高，TLR4、NF-κB mRNA相对表达量均明显降低，差异均有统计学意义（均P＜0.05），见表5。

3 讨论

VILI是一种常见的直接肺损伤，机械应力作用于肺组织后会改变细胞膜结构及体内与之相关的多种信号酶链，可引起肺血管内皮和肺泡上皮直接损伤等病理变化，受损的肺组织瀑布样释放透明质烷、高迁移率族蛋白等导致TLR4被激活，而活化的TLR4/NF-κB信号通路会引发一系列趋化因子、促炎因子蓄积、炎症介质释放，应力性肺损伤转化肺部炎症失衡性生物伤[11]。本研究依据文献[9]介绍的方法，采用潮气量40ml/kg机械通气4h制备大鼠VILI模型。VILI组BALF中CC-16浓度明显升高，肺组织内过量炎性细胞浸润、肺泡结构破坏、肺泡壁增厚、肺泡腔增大等改变提示模型制备成功。

CC-16是由clara细胞和肺泡上皮细胞分泌的一种特异性功能蛋白，因其分子量小、易入血液循环的特点，常被用作反映肺-血管屏障功能及肺损伤严重程度的指标[12]。有学者认为BALF中炎症因子TNF-α、IL-6浓度与VILI程度密切相关，VILI早期明显升高可特异性反映VILI严重程度，或可作为诊断呼吸机相关肺炎导致的急性肺损伤和（或）急性呼吸窘迫综合征的潜在生物学标志物[13]。Cav-1是位于细胞膜小窝内表面的的标志蛋白和整合蛋白，在调控炎性反应、肿瘤转移等病理过程中发挥着关键的桥梁作用。它能调节炎症细胞和炎症因子的产生，通过调控炎症细胞的广泛释放来改善呼吸系统病情[14]。既往研究表明，Cav-1还可以调节人气道上皮细胞TLR4/NF-κB信号通路活性[15-16]。然而，Cav-1在VILI病理、生理过程中的作用尚未阐明，目前存在一定的争议。

众所周知，Dex具有特异性抗炎、脏器保护等作用，是目前研究热点。本研究参照文献[8]并结合课题前期实验，DV组选择5μg/kg预注射及5μg/（kg·h）剂量持续静脉泵注。研究结果发现C组IQA、W/D，CC-16、TNF-α、IL-6 浓度，Cav-1、TLR4、NF-κB 蛋白及 mRNA 相对表达量均在较低水平，而VILI组IQA、W/D升高，TLR4、NF-κB蛋白及mRNA相对表达量增加，CC-16、TNF-α、IL-6释放增多，这表明VILI诱发了TLR4/NF-κB信号传递链启动，炎症介质随之过量释放，炎性反应失衡导致IQA、W/D升高，导致VILI发生、发展。值得注意的是，本研究同时发现Cav-1蛋白及mRNA相对表达量随着肺部机械应力性病变明显下降，与预实验和前期研究结果相符[16]。而Cav-1的重要功能之一是通过调控TLR4/NF-κB信号通路参与炎性反应，因此本研究VILI的发生可能与Cav-1下调、TLR4/NF-κB活性增强有关。与V组比较，DV组肺组织Cav-1蛋白及mRNA相对表达量明显升高，笔者推测预注射Dex能改善损伤应激导致的Cav-1下调情况，保证Cav-1能继续发挥抑制TLR4/NF-κB信号通路的作用，减轻炎性反应，从而减轻大鼠VILI程度，这与Powter等[6]研究结果一致。但DV组肺损伤情况并未得到完全缓解，这说明炎性反应是VILI发生的关键，但不是唯一机制，其他分子机制的参与仍需进一步研究证实。

综上所述，Dex能上调大鼠肺组织Cav-1表达，有效抑制TLR4/NF-κB信号通路，减少VILI引起的TNF-α等炎症因子释放，减轻肺部炎症水肿，从而对VILI发挥保护作用。Dex减轻肺损伤的机制与上调Cav-1有关，增加Cav-1表达可能成为防治VILI药物作用方向。对于Dex通过何种机制调控Cav-1表达，有待进一步深入研究。