重组菌低温冷冻保藏试验

田广文，程雪妮

(西北农林科技大学 生命科学学院，陕西 杨凌 712100)

菌种保藏原理是运用干燥、低温和隔绝空气的手段，抑制微生物代谢，使其生命代谢处于半永久性休眠期，尽可能减少突变，达到长期保藏的目的[1,2]。在教学实验中，针对菌种或不同的实验要求，试验选择最适宜的菌种保存方法，避免其保存期间变异、衰退或死亡，显得尤其重要。

生物工程技术教学实验室长期保存着多种重组菌(含人工重组DNA，特点是可表达人工产物)，这些菌种若保存不妥很易发生变异、退化或死亡。因此，保存菌种要有针对性选用最合适的保存方法。本课题组前期试验用近年兴起的甘油保存法，30%甘油浓度冷冻保存重组菌效果明显好于用50%浓度的，但关于甘油保存重组菌浓度范围报道有争议。于是，本试验对教学实验所用的5种重组菌以不用甘油浓度组进行了360 d冷冻保存试验，以寻求最适宜的保存浓度，更好地为教学、科研提供参考。

1 菌种保藏材料、方法及优缺点

从表1[3,10]可以看出，甘油冷冻保存法简单、经济、实用，值得试验研究。

2 甘油低温保存菌种法研究进展

(1)张爱梅[5]、钟志宏[11]等对甘油保存菌种方法进行改良，即细菌种纯化接于肉汤管，4～6 h增菌后，加入适量甘油生理盐水保存液，冰箱-20℃保存。3年保存期内，各菌保存效果良好。

(2)郭淑清[12]、黄霞云[13]等实验将生长良好培养物5份，加体积分数为0.8甘油生理盐水保存液2份，混匀(甘油浓度为22%)，分装于灭菌有标记的连盖小塑料管中，每管约0.2 mL，封盖，存入-20℃冰箱。于保存1 a末、2 a末、9 a末分别取样培养，检测结果全部生长良好，性状与保存前一致。说明甘油生理盐水冻存菌种不易变异。

(3)张爱梅[5]、黄霞云[13]等[10,14]文献对比研究了多种保藏法，分析得出“抵抗力较强菌种，超低温保存能存活15 a以上，低温保存能存活5 a以上”；“耐受力特别弱菌种，超低温保存能存活5 a以上，低温保存能存活2 a以上”；“实验室用低温保存菌株法较合理，但微生物检查所用菌种的传代次数不得超过5代，应用前应对菌种的纯度和特性进行确认”。可见低温保藏菌种范围广，值得试验研究。

(4)孙萍[16]等论文指出“菌株冷冻时加入一些低温保护剂可以保护菌株。如加甘油，能渗透到细胞内，延缓细胞内冰晶的形成，并能保护细胞内液体物质浓缩的影响”。“但甘油原液保存法因甘油的脱水作用使其保存菌株效果不佳，某些菌株容易死亡”。由此甘油液保存浓度是试验的关键。

3 材料与方法[1,7]

以笔者实验室常用的重组菌为试验材料，以-20℃低温保存法配比多种浓度甘油进行保存试验，以期为重组菌株实验室保存提供理论依据。

表1 菌种保藏材料及方法对比

3.1 菌种

本实验室保藏的重组菌P38、GFP、4T-1和空菌株TOP10、BL21。

3.2 甘油保存液

体积分数为0.5的甘油溶液，即分析纯甘油5份加入去离子水5份，充分混合，121℃灭菌20 min后备用。

3.3 试剂

配制LB液体、固体培养基(胰蛋白胨1.0%、酵母提取物0.5%、NaCl 1.0%，固体的加琼脂粉1.5%)各50 mL、150 mL若干，121℃灭菌20 min备用。

含抗生素的培养基：氨苄青霉素加入冷却无菌水，配成100 mg·mL-1母液于-20℃冰箱冻存。Amp母液解冻加于灭菌冷却至60℃的LB液体培养基或固体培养基中，混匀，Amp终浓度为100 μg·mL-1。制固体培养基的要立即倒平板，倒置于4℃条件下保存。

质粒小提试剂盒(离心柱型 50preps)：天根生化科技(北京)有限公司无水乙醇和TBE缓冲液。

TBE缓冲液(5×)：Tris 54 g，0.5 mol·L-1EDTA (pH值8.0) 20 mL，加去离子水混合完全溶解，定容至1 L备用。

3.4 菌种保存管

Eppendorf管1.5 mL包装，同上高压蒸汽灭菌，烘干备用。

3.5 保存方法[1,10～13,14～17]

将-70℃冻存含质粒的大肠杆菌GFP、P38、4T-1以划线方式接种于Amp+的LB平板(Amp含量100 μg·mL-1)上，空菌株TOP10、BL21也划线接种于不含Amp的LB平板上，每种菌涂3个板，倒置37℃培养16～24 h，挑单个典型菌落分别接种于30 mL含或不含Amp的LB液体培养基中，于37℃振荡(转速180 rpm)培养至OD600值1.0(有研究[1]指出，菌种保存时应选细胞生长对数期即OD600值为0.8或稳定期早期即OD600值为1.0)，混加灭过菌的甘油保存液(体积分数0.5)，使甘油终浓度分别为8%、15%和25%，分装于灭菌有标记的Eppendorf管中，每管1.0 mL，扣紧盖，每个重复装6支，立即放入-20℃冰箱中冻存。次日每种菌取1管融化，接种于LB平板，确证生长良好且无污染，其余各管即可长期保存。

3.6 菌种活化力检测

本实验采用最常用的平板活菌计数法。具体操作如下：

3.6.1 梯度稀释 360 d后取出一套-20℃甘油冻存重组菌，室温解冻，待测菌液按梯度稀释1 ∶104、1∶105和1∶106。吸100 μL的稀释菌液于含Amp+的LB固体平板上 (Ø9 cm)，无菌刮铲涂匀，37℃倒置培养16～24 h。以单菌落数乘以菌液的稀释倍数，即为菌液稀释前的活细胞数。

3.6.2 质粒检测 用质粒小提试剂盒标准碱裂解法提取质粒，以琼脂糖凝胶电泳法来检测DNA分子量大小。

4 结果与分析

4.1 -20℃甘油冻存的重组菌各处理组的活细胞数

360 d后取出一套-20℃甘油冻存重组菌，室温解冻，以平板菌落计数法检测各组活细胞数见表2。

从表2可知，含质粒菌的活细胞数15%甘油组>25%甘油组>8%甘油，其中P38的活细胞数>GFP的活细胞数>4T-1的活细胞数；而不含质粒的空菌株活细胞数25%甘油组>15%甘油组>8%甘油组，且BL21的活细胞数>TOP10的活细胞数。由此，-20℃冷冻保藏重组大肠杆菌时，宜在菌液OD600值为1.0，甘油终浓度保持15%～25%为佳。

表2 OD600值为1.0的菌液在-20℃冻存360 d的活细胞数

4.2 -20℃甘油冻存的重组菌各处理组质粒提取的电泳图

各处理组-20℃保存360 d，取出培养活化菌液OD600值为1.0时各吸取1.4 mL，以标准碱裂解提取质粒试剂盒分别提取质粒，然后以150 μLTBE缓冲液进行溶解，再分别吸取10 μL质粒量进行琼脂糖凝胶电泳(1.0% agarose 见图1)。由图1可知，本实验保存的重组菌，8%甘油组的质粒与15%甘油组的质粒均正常未有丢失。图中P38质粒大小为3 600 bp，GFP质粒大小为5 400 bp，4T-1质粒大小为4 900 bp。

4.3 -20℃甘油冻存的重组菌各处理组稀释观察菌落生长

上面采用平板菌落计数法检测各处理组活细胞数时，稀释各组菌落生长速度有明显差异，即在37℃培养下，含质粒菌的菌落生长需20～22 h，而不含质粒的空菌株菌落生长只需16～18 h。

5 结论与讨论

(1)试验得出，不同浓度甘油低温冷冻保存不同重组大肠杆菌菌株效果明显有差异。保存360 d测试结果表明，含质粒菌的活细胞数15%甘油组>25%甘油组>8%甘油组，P38的活细胞数>GFP的活细胞数>4T-1的活细胞数，且8%甘油组与15%甘油组的质粒含量大小无差异；而不含质粒空菌株的活细胞数25%甘油组>15%甘油组>8%甘油组，且BL21的活细胞数>TOP10的活细胞数。可见，-20℃冷冻保藏重组大肠杆菌时，宜在菌液OD600值为1.0，甘油终浓度保持15%～25%为佳。这与多数文献[2,10～11,14～17]的实验得出“甘油低温保存一般宜15%～22%浓度”相近。而周智慧[1]论文认为重组菌“在甘油浓度>10%会导致质粒不稳定，易引起质粒丢失。保种时应保持甘油终浓度为8%”。有出入，待于商榷。

(2)试验重组大肠杆菌-20℃甘油液保存后，取出活化时菌落生长速度与是否含质粒有差异，即37℃恒温培养下，含质粒菌的菌落生长需20～22 h，而不含质粒的空菌株菌落生长只需16～18 h。此点未见有文献报道。

(3)试验证明，15%～25%甘油液-20℃冷冻保存重组菌种“方便、有效、经济实用”。也为保证生物技术实验教学的有序进行提供了方便。