基于非靶向代谢组学的白茶与绿茶、乌龙茶和红茶代谢产物特征比较

李鑫磊，俞晓敏，林 军,4，赵小嫚，张 妍，林宏政,5，郝志龙,5，金心怡,5,*

（1.福建农林大学园艺学院，福建 福州 350002；2. 福建农林大学 福建省茶学重点实验室，福建 福州 350002；3.福建农林大学海峡联合研究院园艺植物生物学及代谢组学研究中心，福建 福州 350002；4.福建微生物研究所，福建 福州 350007；5.福建农林大学茶叶研究所，福建 福州 350002）

福建省特种茶类包括绿茶、红茶、乌龙茶和白茶[1]，其中白茶产量2016年占全国产量的80%左右[2]。白茶以其独特的甘甜、醇爽的品质风格越来越为消费者所接受[3]。白茶具有良好的保健功效，在白茶原产地素有“一年茶，三年药，七年宝”的说法[4]，研究证明，白茶具有保护小鼠肝脏和脑部组织免受急性氧化应激损伤[5]、保护神经细胞[6]以及抗癌[7]等作用。白茶全程萎凋后直接烘干的加工方式造成其内特殊的代谢物积累模式，从而形成其独特的品质与保健特点。

近年来，越来越多研究关注于白茶的代谢物积累与其形成的加工原理[8-9]。已有研究表明，白茶与绿茶和红茶之间代谢物含量分布存在较大差异[8]，儿茶素组分含量低于绿茶而高于红茶，而茶黄素则相反[10]，游离氨基酸总量高于绿茶、乌龙茶、红茶和黑茶[11]。然而，目前进行的研究大多基于靶向测定不同茶类样本中特定的物质含量，对茶样整体代谢物特征进行比较分析的研究尚少，且尚未有针对白茶、绿茶、乌龙茶和红茶这4 类福建省特种茶类之间代谢差异物质及其加工原理的非靶向代谢组学研究。

福云六号与黄旦茶树品种均为福建省广泛种植的国家级优良茶树品种，适制绿茶、乌龙茶、红茶和白茶[12]。其中，福云六号因其适制性广、成茶品质优异[13]等特点，已成为福建省栽种面积最大的品种，部分茶区甚至占85%以上[14]；黄旦品种适制性同样较广，制成的绿茶、乌龙茶和红茶品质俱佳[12]。福云六号品种为大叶种[12]，而黄旦为中叶种原产于福建南部[12]。因此，本研究选择福云六号与黄旦茶树品种一芽二三叶鲜叶为原料，按照白茶、绿茶、乌龙茶和红茶加工方法制成相应茶类。使用超高效液相色谱-四极杆飞行时间质谱测定白茶和其他茶类中全部代谢物质丰度，进而筛选并鉴定出白茶与其他茶类之间差异代谢物，通过对比白茶与其他茶类之间差异代谢物丰度，探究白茶代谢物特征及其加工学原理，以期为白茶加工工艺改良、滋味品质提升和功能性成分富集等方面研究提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

嫩度为一芽二三叶的福云六号、黄旦茶树鲜叶各25 kg于2016年10月采自福建麒麟山茶叶有限公司与福建农林大学南山茶园。将各品种鲜叶平均分成5 份，1 份用于原料直接热风固样、烘干为鲜叶样品，其余4 份根据不同加工方法分别制成为绿茶、乌龙茶、红茶和白茶（图1）。

表没食子儿茶素没食子酸酯（epigallocatechingallate，EGCG）、表没食子儿茶素（epigallocatechin，EGC）、儿茶素（catechin，C）、表儿茶素没食子酸酯（epicatechingallate，ECG）、表儿茶素（epicatechin，EC）、没食子儿茶素（gallocatechin，GC）、没食子儿茶素没食子酸酯（gallocatechin gallate，GCG），纯度≥95%；乙腈（质谱级）、甲醇（色谱级）、甲酸（纯度98%） 美国Sigma公司；去离子水通过Milli-Q净水系统获得。

图1 不同茶类加工工序与工艺参数Fig. 1 Processing procedures and parameters of different types of tea

1.2 仪器与设备

超高效液相色谱-四极杆飞行时间质谱仪 美国Waters公司；KQ-300GDV恒温数控超声波清洗器昆山超声仪器公司；Milli-Q Advantage A10纯水系统德国Merck Millipore公司；7754070冷冻干燥机 美国Labconco公司；MC京制00000246精密天平 德国Sartorius公司；5430R台式高速冷冻离心机 德国Eppendorf公司；G560E涡旋振荡器 美国Industrial Industries公司。

1.3 方法

1.3.1 茶样前处理[15]

将各茶类毛茶分装于50 mL Eppendorf离心管中，离心管盖戳洞后放入冷冻干燥机中冻干，冻干条件为真空度0.02 mbar、温度-50 ℃。冻干后的毛茶用研砵研磨成均匀粉末，称取30 mg，加入1 mL甲醇。涡旋混匀后于25 ℃超声20 min，12 000×g离心10 min，后转移上清液至离心管中，放置-20 ℃冰箱保存。用前稀释50 倍，各茶叶样本均有3 个生物学重复。

1.3.2 仪器检测条件[15]

利用超高效液相色谱-四极杆飞行时间质谱系统进行数据采集。

超高效液相色谱条件：色谱柱：BEH C18（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）；柱温：40 ℃；流动相A（0.1%甲酸溶液），流动相B（含有0.1%甲酸的乙腈溶液）；梯度洗脱：0～2 min（100%～93% A、0%～7% B），2～13 min（93%～60% A、7%～40% B），13～14 min（60%～0% A、40%～100% B），14～17 min（0%～100% A、100%～0% B）；流速：0.3 mL/min。

飞行时间质谱条件：电喷雾离子源（electron spray ionization，ESI）；检测模式ESI-；毛细管电压1.5 kV；全信息串联质谱碰撞能量10～40 eV；扫描范围50～1 200 Da；离子源温度120 ℃；去溶剂化温度500 ℃；去溶剂化流速800 L/h；锥孔电压40 V。

1.4 数据处理

超高效液相色谱-四极杆飞行时间质谱原始数据利用Waters MassLynx采集，采集到的数据再导入到Progenesis QI 2.1（Nonlinear Dynamics公司）软件中进行峰对齐、峰识别、归一化等数据前处理。差异化合物筛选条件：P＜0.05、VIP＞1、Fold Change＞1.5，再利用SIMCA 13.0（Sartorius公司）对筛选后的物质进行主成分分析以及载荷图绘制。比对HMDB、Metlin、Massbank等数据库、标准物质以及相关文献对筛选出物质进行鉴定。

图表制作利用Microsoft Office 2010（微软公司），绘制热图利用MeV 4.9.0（J. Craig Venter Institute公司），显著性分析利用SPSS 19.0（IBM公司）Turkey HSD检验。

2 结果与分析

2.1 白茶和其他茶类整体代谢物分布特征分析

不同茶类样本中共检测到2 717 个物质信号，这些信号经筛选后，福云六号品种筛选出的不同茶类之间代谢差异物为152 个，黄旦品种筛选出的不同茶类之间代谢差异物为148 个。上述代谢差异物信号经过标准样品、数据库和参考文献比对，共鉴定出33 个差异代谢物（表1），其中包括6 个单体儿茶素类、3 个儿茶素衍生物类、1 个水解单宁、4 个花青素类、11 个黄酮醇或黄酮糖苷类、4 个酚酸类以及4 个茶黄素类。

图2 白茶及其他茶类的主成分分析Fig. 2 Principle component analysis plots for white tea and other types of tea

主成分分析图可反映样本中代谢物丰度情况，样本之间位置越近则越相似越远则反之。从图2可以看出，福云六号品种的主成分分析中，第1主成分占62%，第2主成分占31.6%，总和为93.6%；黄旦品种的主成分分析中，第1主成分占71.7%，第2主成分占16%，总和为87.7%，上述2 个品种的第1、2主成分已包含不同茶类中大部分的物质信息。可以看出，不同茶类之间得到较好分离，绿茶位置与鲜叶样品最接近，接近第1主成分负轴的轴线，而白茶位于第1主成分的正轴，第2主成分的负轴位置，显示白茶与绿茶在第1主成分和第2主成分上化合物均存在明显差异。从第1主成分方向上看，由负轴到正轴依次为鲜叶样品、绿茶、乌龙茶、白茶和红茶，绿茶和红茶之间距离最远，显示第1主成分中的化合物反映了茶样的发酵程度。从第2主成分方向上看，绿茶、乌龙茶和红茶均在第2主成分的正轴上，而白茶位于第2主成分的负轴，显示白茶代谢产物在第2主成分中的独特性。

表1 不同茶类中鉴定出的差异代谢物Table 1 Differential metabolites identified among different types of tea

图3 白茶与其他茶类的差异物质载荷图Fig. 3 Loading plots for white tea and other types of tea

主成分载荷图反映样本中代谢物在不同主成分中的分布。从图3可以看出，第1主成分负轴分布的物质主要为儿茶素、儿茶素衍生物和花青素组分，对应鲜叶样品与绿茶样本位置；正轴为茶黄素、酚酸和黄酮醇或黄酮糖苷类物质，对应红茶与白茶。第2主成分正轴分布主要为非酯型儿茶素组分、茶黄素组分、花青素组分，对应鲜叶样品、绿茶、乌龙茶和红茶，负轴分布主要为酯型儿茶素、儿茶素衍生物和黄酮醇或黄酮糖苷类物质，对应白茶。因此，黄酮醇或黄酮糖苷类物质、酯型儿茶素以及儿茶素衍生物是白茶区别于其他茶类的主要代谢特征。

2.2 黄酮醇或黄酮糖苷在白茶和其他茶类中的代谢特征分析

图4 白茶与其他茶类中鉴定出的物质丰度热图Fig. 4 Heatmaps of abundances of the identified compounds in white tea and other types of tea

茶叶中主要的黄酮醇或黄酮糖苷苷元为山柰酚、槲皮素、杨梅素和芹菜素等[24]。从图4可以看出，白茶中大部分黄酮醇或黄酮糖苷显著高于其他茶类，显示白茶加工工艺有利于黄酮醇或黄酮糖苷类物质保留与积累。而不同苷元的糖苷在其他茶类中分布不一，绿茶中山柰酚糖苷显著低于红茶，在福云六号中显著低于乌龙茶；乌龙茶槲皮素糖苷较低；红茶中杨梅素糖苷显著低于其他茶类。研究表明，绿茶和乌龙茶在杀青过程均引起大部分黄酮醇或黄酮糖苷降低[25-26]，说明制茶过程中的高温条件会引起黄酮醇或黄酮糖苷类物质分解，含量降低。研究也表明，红茶在发酵后，大部分酮醇或黄酮糖苷类物质开始明显降低，特别是杨梅素糖苷[27]。白茶在加工全程未经历高温处理，叶片结构完整，因此黄酮醇或黄酮糖苷类物质在白茶中得以保留[8]。另外，茶叶中黄酮醇糖苷、花青素和儿茶素组分存在共同前体（图5），白茶特殊的加工工艺可能有利于前体物质形成黄酮醇或黄酮糖苷，并引起该物质积累。

图5 儿茶素组分、黄酮醇糖苷和茶黄素代谢通路简图Fig. 5 Simplified metabolism pathways of catechins, flavonol glycosides and theaf l avins

2.3 单体儿茶素和花青素组分在白茶和其他茶类中的代谢特征分析

从图4可以看出，白茶大部分儿茶素组分显著低于绿茶，非酯型儿茶素与红茶相当，而酯型儿茶素如EGCG和ECG显著高于红茶，显示白茶加工工艺引起儿茶素组分较大程度降低，其中非酯型儿茶素降低更明显。研究表明，儿茶素在摊放和萎凋过程就开始降低转化[28-29]，绿茶杀青使多酚氧化酶等酶类活性钝化后儿茶素在杀青后得以保留[30-31]；乌龙茶萎凋后进入做青工序，做青时，茶叶叶缘区域由于受到机械力作用，集中于液泡中的儿茶素组分[32]因液泡膜透性增加而与细胞质基质中多酚氧化酶等酶类接触[33]，儿茶素组分因受到部分酶促氧化而较绿茶更低，乌龙茶的叶缘区域也因此变红，形成“三红七绿”的品质特征；红茶萎凋后进入揉捻和发酵工序，揉捻使鲜叶细胞膜和细胞壁充分破碎，儿茶素组分与多酚氧化酶等酶类充分接触，在发酵2 h后大量降低，茶黄素组分和茶双没食子儿茶素等儿茶素氧化产物显著增加，形成“红汤红叶”的品质特征[34]；白茶全程萎凋的工艺特点使得叶片物理结构保持完整，酶活性未受破坏，但儿茶素仍有较大幅度降低，特别是非酯型儿茶素。白茶中降低的儿茶素组分可能通过氧化聚合等作用形成茶黄素、茶红素、儿茶素衍生物等其他复杂的中间产物[35]。最近，白茶中分离出茶氨酸与儿茶素组分组成的衍生物[36-37]，也发现儿茶素聚合物茶双没食子儿茶素A和B在白茶中有较高积累[8]。

从图4可以看出，花青素组分与儿茶素组分规律类似，大部分花青素组分在白茶和红茶中明显低于鲜叶样品、绿茶和乌龙茶。研究表明，花青素及其苷类物质在萎凋和发酵过程中降低[38]。

2.4 茶黄素组分和儿茶素衍生物在白茶和其他茶类中的代谢特征分析

茶黄素组分是红茶中主要的酚类物质，由儿茶素组分转化而来[39]。从图4可以看出，绿茶由于发酵程度最低，因此4 种茶黄素组分均显著低于红茶。红茶所有茶黄素组分均显著高于绿茶，而乌龙茶茶黄素含量均介于绿茶与红茶之间，显示出乌龙茶做青工序与红茶揉捻和发酵工序对茶黄素形成机理类似，只是做青工序造成的发酵程度更低。而白茶中茶黄素和黄旦品种中的茶黄素-3-没食子酸酯显著高于绿茶，茶黄素-3’-没食子酸酯和茶黄素-3,3’-没食子酸酯则与绿茶之间无显著差异，显示白茶加工过程中茶黄素积累存在组分特异性。说明白茶的茶黄素积累方式与乌龙茶和红茶有所不同，可能是由于白茶在加工过程中叶片细胞结构始终未受到机械力作用导致。

由酯型儿茶素转化而成的茶黄素-3’-没食子酸酯和茶黄素-3,3’-没食子酸酯在白茶中积累量少，因此推测降低的酯型儿茶素可能更多地自动氧化、异构化或形成儿茶素衍生物[36,40]。8-C-抗坏血酸基-EGCG是EGCG与抗坏血酸形成的一种衍生物，从图4可以看出，白茶中8-C-抗坏血酸基-EGCG显著高于其他茶类，而其他茶类之间并无显著差异，显示白茶加工工艺有利于8-C-抗坏血酸基-EGCG的积累。8-C-抗坏血酸基-EGCG被证明对艾滋病有治疗作用[41]。抗坏血酸和EGCG在室温条件下反应6 d后，8-C-抗坏血酸基-EGCG不断大幅增加，而6-C-抗坏血酸基-EGCG则增加量较少[40]。白茶加工过程中经历的长时间萎凋（48～72 h）可能是8-C-抗坏血酸基-EGCG在茶叶中积累的原因。

3 结 论

本实验通过应用非靶向代谢组学方法对由鲜叶原料加工而成的白茶与绿茶、乌龙茶、红茶中的所有代谢产物进行测定、筛选并最终鉴定出茶叶中33 种主要的代谢产物。主成分分析表明白茶特征代谢产物为黄酮醇或黄酮糖苷类物质、酯型儿茶素和儿茶素衍生物。白茶中黄酮醇或黄酮糖苷类物质显著高于其他茶类；儿茶素显著低于绿茶并接近红茶，特别是非酯型儿茶素，花青素与儿茶素相似；与红茶和乌龙茶中酯型儿茶素聚合形成茶黄素-3-没食子酸酯与茶黄素-3,3’-没食子酸酯不同，白茶中酯型儿茶素可能更多地形成衍生物如8-C-抗坏血酸基-EGCG。白茶特殊的加工特点形成了白茶上述独特的代谢产物特征，加工对白茶特定代谢物影响的机理尚待进一步深入研究。