通络益脑方对急性局灶性脑缺血模型大鼠炎症因子及脑细胞自噬相关蛋白的影响∗

于法敖 林 艳 吴 栋 盛正乾 矫琰庆 梁 琳

（1.山东省青岛市即墨区中医医院，山东 青岛 266200；2.上海市第六人民医院，上海 201400）

目前世界卫生组织认为脑血管疾病是危害人类生命和健康的三大高危疾病之一，缺血性脑血管病最为常见，约占脑血管疾病的70%～80%，其发病率高、致残率高、死亡率高。缺血性脑缺血是因脑部血液循环障碍导致的局限性脑组织缺血坏死，停止供血、供氧，局部脑组织崩解破坏，脑组织受损[1]。急性局灶性脑缺血患者在发生和发展中多伴有炎症反应。自噬参与细胞死亡的同时也保护恶劣环境中神经元维持自我内环境稳定性，在脑缺血神经元死亡中具有重要的作用。中医学认为急性局灶性脑缺血痰瘀互结、脑脉不通所致，兼夹气血、脾胃升降失调，治宜活血醒脑开窍[2-3]。通络益脑方具有活血通络、补肾益智之功效，为本院治疗缺血性脑卒中患者的院内协定处方，具有较好的临床疗效[4]，但其作用机制尚不明确。因此本研究旨在观察通络益脑方对急性局灶性脑缺血模型大鼠脑组织病理学、炎症因子及脑细胞自噬相关蛋白的影响，并探讨其作用机制，旨在为临床提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物

雄性SD大鼠，体质量（200±20）g，购于上海邦耀生物科技有限公司。置于（23±2）℃室温中，昼夜节律，自由饮水进食，适应环境7 d后于9∶00～17∶00进行实验。

1.2 药物与试剂

1）药品。通络益脑方：黄芪 25 g，丹参 21 g，红花、桃仁、川芎各18 g，何首乌15 g，远志、肉苁蓉、石菖蒲各12 g，水蛭、地龙各9 g，茯苓6 g。加8倍量（以重量计）水，浸泡1 h，煮沸30 min，双层纱布过滤，留滤液，药渣再加6倍量水，煮沸20 min，用上法过滤，合并两次滤液，65℃恒温水浴浓缩成0.25 g/mL，1 g/mL的煎煮液，放凉后待用，灭菌保存于4℃冰箱备用。2）试剂。水合氯醛（国药集团化学试剂有限公司），苏木素和伊红以及TTC（Sigma公司）、BCA蛋白定量试剂盒和Trizol试剂盒（武汉博士德生物工程有限公司）、Beclin-1和Bcl-2抗体（Sigma公司）、PCR试剂盒（南京诺唯赞生物科技有限公司）、尼莫地平片（拜耳医药保健公司，生产批号：L01984）；BDNF的ELISA试剂盒、TUNEL凋亡试剂盒和DAB显色试剂盒购于武汉博士德生物工程有限公司；PBS缓冲液和二抗由碧云天生物技术研究所提供；其他试剂均为分析纯，购于天津市广成化学试剂有限公司；氯化钠注射液（批号：07112133）由山东康宁药业有限公司提供，实验用水为超纯水。

1.3 实验仪器

TD5A-WS/TD5AWS型低速离心机（湖南湘仪离心机有限公司），BX61型显微镜（日本OLYMPUS公司），Image-Pro Plus 6.0图像分析系统（麦克奥迪实业集团有限公司），RM2125型切片机和TPIIZO型全自动封闭式组织脱水机（德国徕卡公司），pH计（北京屹源电子科技有限公司），超低温冰箱[冠森生物科技（上海）有限公司]，Y6-6LF型生物组织包埋机（上海世仪生物技术有限公司），电子天平（上海良平仪器有限公司），控温水浴箱GKC（上海苏达实验仪器有限公司）。

1.4 分组与造模

1）分组：SPF级雄性SD大鼠，每笼5只，自由饮水进食，在室温（23±2）℃下，通风良好的环境下自由饮食适应性喂养7 d后，进行敞箱实验。将评分相近的60只SD大鼠随机分为5组，每组10只，包括：假手术组、模型组、高剂量组、低剂量组和尼莫地平组。2）模型制备：参考文献[5]制备急性局灶性脑缺血大鼠模型，将模型组及用药组（尼莫地平组与高、低剂量组）大鼠，水合氯麻醉，俯卧固定于手术台，采用改良线栓法制作脑缺血大鼠模型，分组分笼饲养，不禁食水。假手术组大鼠仅用玻璃分针游离出双侧颈总动脉不做结扎处理。

1.5 干预方法

造模成功后，假手术组自由饮水进食；模型组开始灌服纯净水；高剂量组灌服通络益脑方200 mg/kg；低剂量组灌服通络益脑方50 mg/kg；尼莫地平组开始以10 mg/kg灌服尼莫地平。模型组和用药组每日灌胃1次，连续3周。

1.6 观察指标

1.6.1 神经功能评分 采用Bederson评分分级法，于术后第3周对各组大鼠进行神经行为学评分并记录结果。采用改良NSS评分标准对各组大鼠神经功能进行评分（16分制）。得数越高，损伤程度越重。

1.6.2 脑组织取材及处理 造模成功3周后，断头处死大鼠后迅速剥取脑组织，置于-20℃冰箱中15 min。取出脑组织，去掉嗅球、小脑、低位脑干，0.9%氯化钠注射液清洗，固定48 h后，二甲苯脱脂，酒精脱水，石蜡包埋，切片。取切片置于2%TTC染色液中染色，避光孵育30 min，10%甲醛固定，通过经图像分析系统测量脑梗死面积。其中梗死的脑组织呈白色，正常的脑组织为红色。取切片脱蜡脱水，置于TUNEL试剂盒反应液和复合液中进行DAB显色，苏木素染色5 min后封片，阴性对照置于蒸馏水中，显微镜下观察神经细胞凋亡情况，选取5个400倍视野分别计数凋亡细胞数目。

1.6.3 炎症因子的测定 3周后收集3 mL外周血液，离心，分离血清，ELISA法检测肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白细胞介素-1β（IL-1β）、白细胞介素-2（IL-2）及白细胞介素-6（IL-6）炎症因子水平以及ICAM-1水平，严格按照试剂盒说明书操作。

1.6.4 自噬相关蛋白的测定 3周后断头取脑，称取200 mg脑组织进行样品制备，Trizol法提总RNA，严格按照逆转录试剂盒和相关引物的说明书加入相应量的试剂进行聚合酶链反应，BCA法测定蛋白浓度，RTPCR 检测PI3K、Akt、Beclin-1以及Bcl-2蛋白相对表达水平。

1.7 统计学处理

2 结果

2.1 各组大鼠神经功能评分和神经行为学评分比较

见表1。模型组大鼠的神经功能评分和神经行为学评分明显高于其余各组（P＜0.05）。给药后，尼莫地平组和高、低剂量组大鼠的神经功能评分和神经行为学评分明显低于模型组（P＜0.05），低剂量组大鼠的神经功能评分和神经行为学评分与高剂量组以及尼莫地平组比较均有显著性差异（P＜0.05），高剂量组与尼莫地平组比较无显著性差异（P＞0.05）。

表1 各组大鼠神经功能评分和神经行为学评分比较（分，±s）

表1 各组大鼠神经功能评分和神经行为学评分比较（分，±s）

与假手术组比较，△P＜0.05；与模型组比较，▲P＜0.05。下同

组别假手术组模型组尼莫地平组低剂量组高剂量组神经行为学评分0.00±0.00 5.68±1.21△3.08±0.49△▲4.24±0.74△▲3.25±0.52△▲n 10 10 10 10 10神经功能评分0.00±0.00 5.97±1.34△3.14±0.81△▲4.49±0.90△▲3.62±0.76△▲

2.2 各组大鼠脑梗死体积、神经细胞凋亡及ICAM-1比较

见表2。假手术组大鼠的脑组织未见明显病理变化，神经元及神经胶质细胞结构正常，核仁明显可见，模型组脑组织神经元结构模糊构型紊乱，出现不规则不同程度神经细胞变性坏死及炎细胞浸润、核体核深染核的固缩，尼莫地平组和高、低剂量组与模型组相比均有不同程度的缓解恢复，脑组织神经元核固缩核体不规则程度有显著的减轻、软化灶明显减少。见图1。与假手术组比较，模型组大鼠的脑梗死体积、神经细胞凋亡以及ICAM-1明显高于其余各组（P＜0.05），给予药物治疗后，尼莫地平组和高、低剂量组的脑梗死体积、神经细胞凋亡以及ICAM-1水平明显降低（P＜0.05），低剂量组脑梗死体积、神经细胞凋亡以及ICAM-1水平明显高于尼莫地平组和高剂量组（P＜0.05），尼莫地平组和高剂量组间比较无显著性差异（P＞0.05）。

表2 各组大鼠脑梗死体积、神经细胞凋亡及ICAM-1比较（±s）

表2 各组大鼠脑梗死体积、神经细胞凋亡及ICAM-1比较（±s）

组别假手术组模型组尼莫地平组低剂量组高剂量组n 10 10 10 10 10脑梗死体积（%）0.00±0.00 45.37±4.38△32.03±5.01△▲39.24±4.14△▲33.95±3.96△▲神经细胞凋亡（个）11.12±1.87 65.28±7.26△30.98±3.42△▲42.85±3.67△▲32.15±4.05△▲ICAM-1（ng/mL）22.06±3.47 29.24±4.36△23.37±3.59△▲25.64±4.12△▲23.68±3.87△▲

图1 急性局灶性脑缺血模型大鼠脑组织病理图片（HE染色，400倍）

2.3 各组大鼠炎症因子比较

见表3。与假手术组比较，模型组大鼠的TNF-α、IL-1β、IL-2以及 IL-6水平明显升高（P＜0.05）。给予药物干预后，尼莫地平组和高、低剂量组大鼠的炎症因子水平明显降低（P＜0.05），低剂量组大鼠的炎症因子明显高于尼莫地平组和高剂量组（P＜0.05），而尼莫地平组和高剂量组间比较无显著性差异（P＞0.05）。

2.4 各组大鼠PI3K、Akt、Beclin-1及Bcl-2比较

见表4。与假手术组比较，模型组大鼠的PI3K、Akt、Beclin-1以及Bcl-2水平明显升高（P＜0.05）。给予药物干预后，尼莫地平组和高、低剂量组大鼠的自噬相关蛋白水平明显降低（P＜0.05）；低剂量组大鼠的自噬相关蛋白水平明显与尼莫地平组和高剂量组有显著性差异（P＜0.05），而阳性组和高剂量组间比较无显著性差异（P＞0.05）。

表3 各组大鼠炎症因子比较（μg/mL，±s）

表3 各组大鼠炎症因子比较（μg/mL，±s）

组别假手术组模型组尼莫地平组低剂量组高剂量组n 10 10 10 10 10 TNF-α 39.73±6.09 55.57±7.24△41.39±7.05△▲42.37±5.94△▲46.15±7.23△▲IL-1β 4.53±0.67 6.72±0.85△4.66±0.54△▲4.85±0.46△▲4.69±0.71△▲IL-2 3.14±4.59 6.23±3.12△4.12±3.74△▲5.43±3.62△▲4.47±5.26△▲IL-6 21.12±2.67 30.47±3.86△23.57±3.45△▲25..15±2.56△▲23.87±3.09△▲

表4 各组大鼠PI3K、Akt、Beclin-1及Bcl-2比较（±s）

表4 各组大鼠PI3K、Akt、Beclin-1及Bcl-2比较（±s）

组别假手术组模型组尼莫地平组低剂量组高剂量组n 10 10 10 10 10 PI3K（mg/mL）1.07±0.57 3.63±0.84△1.53±0.78△▲1.62±0.62△▲1.56±0.81△▲Akt 0.54±0.13 3.31±1.53△1.24±0.34△▲1.58±0.45△▲1.32±0.51△▲Beclin-1（μg/mL）0.81±0.27 1.68±0.46△0.85±0.32△▲0.98±0.47△▲0.89±0.31△▲Bcl-2（pg/mL）0.76±0.17 1.54±0.36△0.87±0.29△▲1.04±0.32△▲0.91±0.28△▲

3 讨 论

急性脑缺血是神经内科常见重症疾病，其临床病情进展快。神经功能行为学指标可真实反映脑缺血疾病程度，对脑缺血疾病的研究具有重要作用。炎症因子是一种由淋巴细胞、血管内皮细胞、单核细胞以及巨噬细胞所释放的免疫分子[6-7]。研究发现，脑缺血后存在炎症反应，而炎症反应释放大量的氧自由基、一氧化氮、兴奋性氨基酸等毒性物质，相互作用明显造成脑组织不可逆的损伤，可诱发神经细胞凋亡，最终导致脑细胞凋亡甚至坏死，加重脑损伤[8]。TNF-α是炎症反应的起始因子，具有多效促炎性及神经毒性作用，导致内皮细胞功能失调，致使内皮细胞屏障的渗透性增加[9]。IL-1β通过激活内皮细胞促使血栓形成，或增加诱导细胞间黏附分子表达，使大量中性粒细胞浸润到脑组织，诱发炎性反应，是脑缺血损伤的病理生理基础。IL-2是缺血性脑卒中发生发展过程的关键因素之一。IL-6为炎症递质，可加重脑缺再灌注的全身反应和局部损伤。ICAM-l参与炎症反应和体液、细胞免疫应答，是判断急性脑缺血损伤程度最强的免疫指标[10]。

自噬是哺乳动物通过溶酶体系统对细胞质大分子和细胞器进行降解的一个分解代谢过程[11]。PI3K/Akt信号通路是自噬网络系统抗凋亡促存活的信号转导通路，通过抑制细胞凋亡、加速细胞周期进而抑制细胞自噬。PI3K是Akt活化的首要调解者。Akt是PI3K/Akt核心部位，是PI3K的直接靶基因，是信号转导通路中重要的蛋白激酶和抗凋亡调节因子[12]。Beclin1基因是自噬体的必需分子，代表自噬的活性，调节自噬体膜合成和物质转运，是参与自噬的特异性基因。Bcl-2为高度同源蛋白中的经典的抗凋亡蛋白，不仅调节细胞凋亡而且在调控细胞自噬的过程中也有重要作用[13]。此外，Bcl-2还能调控氧化应激诱导自噬和凋亡[14]。Beclin1与Bcl-2家族蛋白持续结合在细胞稳定的内环境下抑制自噬的发生，而在细胞发生饥饿或使用自噬诱导剂情况下Beclin1与Bcl-2的解聚。因此，调控自噬与凋亡负反馈作用的关键因素是Beclin1与Bcl-2的平衡状态。而且Bcl-2蛋白可阻止Beclin1蛋白与PI3KC3特异性结合，或者减少PI3KC3磷酸化活性而起到抑制自噬的作用。

急性脑缺血属于中医学“中风”范畴，痰瘀互结、脑脉不通为其病机，气血、脾胃升降失调，治宜活血醒脑开窍。通络益脑方方中黄芪补气以推动血液运行。丹参、红花、桃仁和川芎活血化瘀。何首乌和肉苁蓉补益肝肾。远志和石菖蒲益智，提高记忆力。水蛭和地龙活血化瘀通络。茯苓补脾利水。诸药合用以达到活血通络、补肾益智之功效。现代药理证实[15-20]，方中的黄芪、丹参、红花、水蛭、地龙以及茯苓的主要有效成分不仅能显著抑制多种变态反应性炎症，对脑缺血大鼠具有脑保护作用，可减轻神经细胞损伤。

本研究结果显示，与假手术组比较，模型组大鼠的神经功能评分、神经行为学评分、脑梗死体积、神经细胞凋亡、ICAM-1水平、TNF-α、IL-1β、IL-2以及IL-6水平、PI3K、Akt、Beclin-1以及Bcl-2水平明显高于其余3组。给药后，尼莫地平组和高、低剂量组大鼠的神经功能评分和神经行为学评分、脑梗死体积、神经细胞凋亡、ICAM-1水平、炎症因子水平以及自噬相关蛋白水平明显低于模型组，低剂量组与高剂量组及尼莫地平组比较均有显著性差异，高剂量组与尼莫地平组比较无显著性差异。结果提示通络益脑方能有效地降低神经功能评分和神经行为学评分，减少脑梗死体积和神经细胞凋亡，降低炎症因子和自噬相关蛋白水平。

综上所述，通络益脑方对急性局灶性脑缺血大鼠脑组织有较好的保护作用，可减少其脑梗死面积，保护脑组织免受炎症因子的损伤，增加自噬相关蛋白水平，减少神经细胞的凋亡，激活脑细胞自我保护。