基于质谱特征碎裂片段的乳制品中真菌毒素非定向筛查方法研究

贾 玮，樊子便 ，杜 安，石 琳，许牡丹，储晓刚,2

(1.陕西科技大学 食品与生物工程学院，陕西 西安 710021；2.中国检验检疫科学研究院，北京 100123)

真菌毒素是霉菌在生长繁殖过程中在一定环境下产生的二次代谢有毒产物，按产毒素的菌种主要分为曲霉菌属、青霉菌属、镰孢菌属、麦角菌属四大类，所产生的毒素主要包括黄曲霉毒素类、赭曲霉毒素类、玉米赤霉烯酮类、伏马毒素类、脱氧雪腐镰刀菌烯醇类、麦角碱类，饲料为养殖环节的主要污染源之一[1-2]。流行病学研究显示，黄曲霉毒素B1与肝癌发生密切相关，已被国际卫生组织国际癌症研究总署确认为A类致癌物质[3-4]。近年来，随着我国乳品行业的发展和消费者食品安全意识的增强，乳品安全问题越来越受到关注，亟待发展真菌毒素的高通量非定向筛查分析方法[5]。

乳制品中真菌毒素的检测方法主要有酶联免疫吸附法(ELISA)、色谱-质谱联用法等[6]，其中酶联免疫法具有特异性强、灵敏度高、前处理简单、易于推广等优点，但此法存在一定的假阳性与假阴性[7-9]。目前，我国颁布的《GB 5009.24-2016 食品安全国家标准 食品中黄曲霉毒素M族的测定》等真菌毒素检测国家标准采用液相色谱-串联质谱实现了食品中真菌毒素的准确定量分析，但受限于不同类别分析时色谱-质谱的差异，无法实现多类别真菌毒素的高通量定性定量分析[10-11]。因此建立乳制品中真菌毒素非定向筛查检测方法具有重要的现实意义和应用价值，也符合国家食品安全发展方向[12-14]。超高效液相色谱-高分辨质谱将液相良好的分离能力、精确质量数与可提供溯源信息等优势相结合，具有高通量、高选择性、高灵敏度等优势，适用于多种目标化合物的筛查和确证分析[15-16]。

本研究采用超高效液相色谱-四极杆-静电场轨道离子阱质谱的数据依赖型扫描模式，对38种典型真菌毒素标准物质化合物色谱信息、分子离子和二级碎裂片段进行采集，建立了真菌毒素标准数据库并完成裂解途径解析与特征碎裂片段筛选；采用数据非依赖扫描，获取可追溯的样品质谱信息，构建了乳制品中真菌毒素的非定向筛查方法。该方法具有前处理简单、分析时间短、灵敏度较高以及定性定量可靠的优势，可满足乳制品中安全风险突发事件快速应急处理工作中高通量、高可靠性确证和定量分析的要求，能够为企业及监管部门提供有力的技术支撑。

1 实验部分

1.1 材料、试剂与仪器

巴氏杀菌乳、超高温瞬时灭菌乳、含乳饮料与婴幼儿配方乳粉购于当地超市；0.22 μm微孔滤膜(美国Pall公司)；C18吸附剂(粒径为40～60 μm，60 Å平均孔径)、PSA吸附剂(粒径为40～60 μm，60 Å平均孔径)、陶瓷均质石(美国Agilent Technologies公司)；无水硫酸镁和无水乙酸钠为优级纯(美国Supelco公司)；乙腈、甲醇、甲酸、乙酸、甲酸铵均为色谱纯，购自美国Sigma公司；38种真菌毒素标准物质购于英国LGC Standards公司和瑞士Fluka公司。

高速冷冻离心机(美国Beckman Coulter公司)；Vortex.Genie2T型旋涡混合器(美国Scientific Industries公司)；超声波清洗器(江苏昆山超声仪器有限公司)；分析天平(瑞士Mettler Toledo公司)；ED-115型恒温干燥箱(德国Binder公司)；超高效液相色谱-四极杆-静电场轨道离子阱质谱(美国Thermo Fisher Scientific公司)；Milli-Q Integral型纯水仪(美国Millipore公司)。

1.2 标准溶液的配制

称取真菌毒素标准品各1.0 mg(精确至0.01 mg)，分别置于10 mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容，配成单标储备液，于-20 ℃避光保存。精密移取单标储备液各1 mL于100 mL容量瓶中，用甲醇-水(体积比1∶1)稀释并定容，配成质量浓度均为1 mg/L的混合标准溶液，于-20 ℃棕色密闭瓶中避光保存。

1.3 样品前处理

对于乳粉等粉状样品，称取婴幼儿配方乳粉3.0 g(精确至0.01 g)于50 mL具塞聚苯丙烯离心管中，加入(45±5) ℃的超纯水(20 mL)后涡旋振荡使其充分混匀。分别称取混匀的巴氏杀菌乳、超高温瞬时灭菌乳、含乳饮料和已溶解的婴幼儿配方乳粉试样各15 g(精确至0.01 g)，于50 mL具塞聚苯丙烯离心管中，加入10 mL乙酸-乙腈-水(体积比1∶84∶15)混合溶液，涡旋混合30 s后加入6.0 g无水硫酸镁、1.45 g无水乙酸钠与陶瓷均质石，再次涡旋30 s，振荡提取1 min，然后在4 ℃以10 000 r/min离心5 min，移取8 mL上层溶液于预先加有405 mg C18、108 mg PSA及1.2 g无水硫酸镁的离心管中，高速涡旋30 s,在4 ℃以10 000 r/min条件下离心5 min。移取上清液过0.22 μm有机系微孔滤膜，取200 μL滤液至2 mL进样小瓶中后加入300 μL甲醇及500 μL 8 mmol/L甲酸铵水溶液，采用超高效液相色谱-四极杆-静电场轨道离子阱质谱测定。

1.4 基质匹配溶液的配制

移取乳制品前处理提取液12份各5 mL于10 mL容量瓶中，氮吹至近干，分别加入真菌毒素标准品混合溶液10、20、40、80、100、200、400、800、1 000、2 000、4 000、5 000 μL于该容量瓶中，各加入5 mL甲醇后，用8 mmol/L甲酸铵水溶液定容，配成1.0、2.0、4.0、8.0、10、20、40、80、100、200、400、500 μg/L的基质匹配标准溶液，用于标准校正曲线的绘制。

1.5 分析条件

色谱条件：Accucore C-18 aQ预柱(10 mm×2.1 mm，1.9 μm)和Hypersil Gold C-18 aQ柱(100 mm×2.1 mm，1.9 μm，美国Thermo Fisher Scientific公司)，柱温：35 ℃；流动相：A为0.1%(体积分数)甲酸-4 mmol/L甲酸铵水溶液，B为0.1%(体积分数)甲酸-4 mmol/L甲酸铵甲醇溶液；梯度洗脱程序：0～1 min，100% A；1～7 min，100%～ 0% A；7～12 min,0% A；12～13 min，0%～100% A，13～15 min，100% A，流速为300 μL·min-1，进样量5 μL。

质谱条件：电喷雾离子化(ESI)，采用正模式；鞘气流速18 L/min，鞘气压力275 kPa，辅助气流速3 L/min；毛细管电压：正离子模式3 500 V；负离子模式3 000 V；离子源温度：50 ℃；毛细管温度：320 ℃。全扫描模式(Full scan)，分辨率设定70 000 FWHM，自动增益控制的目标值(AGC)定为1.0×107，容许质量误差范围5 ppm，最大注入时间250 ms，动态背景扣除(Dynamic exclusion)设定为10.0 s。

全扫描/数据依赖扫描模式(Full MS/dd-MS2)参数：分辨率为17 500 FWHM，自动增益控制的目标值定为5.0×106，出峰后的触发时间(Apex trigger)为3～6 s，最大注入时间120 ms，动态背景扣除为10.0 s，选择TOP 5模式。待碎裂的目标分析物在特定的信息列表(Inclusion list)中设定，容许质量误差范围设定为10 ppm。当待碎裂的离子响应强度达到强度阈值8.3×104时，即送往高能碰撞解离(HCD)碰撞池，通过3个不同的碰撞能量分别进行碰撞，最终叠加得到一张子离子谱图，碰撞能量分别为17.5、35.0、52.5 eV。

可变的数据非依赖采集Variable Data Independent Acquisition(vDIA)参数：扫描时间0～15 min；自动增益控制的目标值设定为5.0×106，最大注入时间为120 ms；分辨率采用17 500 FWHM；信息列表分为：112.801 16、137.812 53、162.823 90、187.835 27、212.846 63、237.858 00、262.869 37、287.880 74、312.892 11、337.903 48、362.914 85、387.926 22、412.937 58、437.948 95、462.960 32、487.971 69、550.500 11、650.545 59、750.591 06、850.636 54，其中112.801 16～487.971 69设定为第一个vDIA扫描，隔离窗口范围(Isolation window)设为25.0 Da，Loop Count设定为16(即16个扫描段)，550.500 11～850.636 54设为第二个vDIA扫描，动态背景扣除10.0 s，隔离窗口范围设为100.0 Da，Loop Count设定为4。碰撞能量分别为17.5、35.0、52.5 eV。

2 结果与讨论

2.1 数据库的建立

同类真菌毒素分子存在结构及质谱碎裂方式的共性。将标准溶液逐级稀释配成质量浓度为500 μg/L用于标准数据库的信息采集。首先运用Full MS/dd-MS2扫描模式采集真菌毒素标准品的MS/MS谱图。其次，从实验谱图中记录各个碎片离子的分子离子主要离子化形式(响应最高)质荷比(理论值)、二级碎裂片段质荷比与保留时间等信息。基于每种真菌毒素的碎裂途径和各个碎片离子间的相对强度，选择丰度比较高且大于10%、同时可用于区分同类别化合物的碎片作为定量信息(表1)[17-18]。构建了MS/MS谱图数据库，数据库包括黄曲霉毒素类(黄曲霉毒素M1、黄曲霉毒素G2、黄曲霉毒素G1、黄曲霉毒素B2、黄曲霉毒素B1)、赭曲霉毒素类(α-赭曲霉毒素、赭曲霉毒素B、赭曲霉毒素A)、玉米赤霉毒素类(β-玉米赤霉烯醇、α-玉米赤霉烯醇、α-玉米赤霉醇、玉米赤霉酮、玉米赤霉烯酮、β-玉米赤霉醇)、伏马毒素类(伏马毒素B3、伏马毒素B2)、镰刀菌毒素类(雪腐镰刀菌烯醇、脱氧雪腐镰刀菌烯醇、葡萄糖苷化呕吐毒素、镰刀菌烯酮X、去环氧-脱氧雪腐镰刀菌烯醇、3-乙酰基脱氧雪腐镰刀菌烯醇、15-乙酰基脱氧雪腐镰刀菌烯醇)、麦角碱类(田麦角碱、麦角克碱、麦角辛、麦角异柯宁碱、麦角异卡里碱、双氢麦角汀)、其他类(黄绿青霉素、杂色曲毒霉素、钙激活钾通道阻断剂、T-2四醇、青霉酸、T-2三醇、腾毒素、橘毒素、HT-2毒素)共38种真菌毒素的正、负离子扫描模式和多种加合物形式([M+H]+、[M+NH4]+、[M+HCOO]-、[M-H]-)合计95张谱图。

表1 38种真菌毒素的标准数据库信息Table 1 Standard database information for 38 mycotoxins

(续表1)

No.CompoundCASMolecular formulaRetention time/minPrecursor(m/z)Ionization modeFragment 1(m/z)Fragment 2(m/z)28Penicilic Acid(青霉酸)90-65-3C8H10O45.0171.065 19[M+H]+C7H7O+3(139.032 56)C7H11O+2(127.077 89)293-Acetyldeoxynivalenol(3-乙酰基脱氧雪腐镰刀菌烯醇)50722-38-8C17H22O75.4339.143 83[M+H]+C14H15O+3(231.101 13)C8H9O+2(137.059 81)3015-Acetyldeoxynivalenol(15-乙酰基脱氧雪腐镰刀菌烯醇)88337-96-6C17H22O75.4356.170 38[M+NH4]+C16H33O+6(321.133 26)C13H15O+2(203.106 45)31T-2 Triol(T-2三醇)34114-98-2C20H30O76.3400.232 98[M+NH4]+C15H21O+5(281.137 91)C12H29O+3(221.113 32)32Ergocorninine(麦角异柯宁碱)564-37-4C31H39N5O56.5560.287 842 8[M-H]-C16H16N3O-(266.120 90)C16H15N3O-(265.120 41)33HT-2 Toxin(HT-2毒素)26934-87-2C22H32O86.8442.243 54[M+NH4]+C16H35O+6(323.110 48)C14H17O+3(233.110 71)34Ergocryptinine(麦角异卡里碱)511-10-4C32H41N5O56.8576.318 05[M+H]+C20H22N3O+(320.175 64)C16H18N3O+(268.138 12)35Beta-Zearalanol(β-玉米赤霉醇)42422-68-4C18H26O56.8323.185 30[M+H]+C18H27O+5(323.188 44)C12H13O+2(189.091 03)36Dihydroergocristine(双氢麦角汀)17479-19-5C35H41N5O56.7612.318 05[M+H]+C21H24N3O+2(350.177 42)C16H20N3O+(270.166 59)37Tentoxin(腾毒素)28540-82-1C22H30O4N46.8413.219 43[M-H]-C10H+15(135.117 20)C9H+13(121.102 01)38Citrinin(橘霉素)518-75-2C13H14O56.4249.076 85[M-H]-C6H7O+5(159.028 32)C8H+13(109.102 29)

2.2 特征碎裂片段筛选及其在真菌毒素残留筛查中的应用

图1 黄曲霉毒素G1的四极杆-静电场轨道离子阱质谱图Fig.1 Quadrupole-orbitrap mass spectrum of aflatoxin G1

2.2.1 断裂途径与机理研究实验研究了38种真菌毒素的碎裂机理，得到了所有片段的质谱裂解反应途径。以黄曲霉毒素G1(Aflatoxin G1)为例，其dd-MS2谱图如图1所示。

图2 黄曲霉毒素G1的碎裂机理示意图Fig.2 Fragmentation mechanism of aflatoxin G1

表2 真菌毒素特征碎裂片段Table 2 Characteristic fragmentations of mycotoxins

2.2.3 特征碎裂片段在真菌毒素筛查中的应用将特征碎裂片段与真菌毒素标准数据库相结合应用于乳制品中真菌毒素的非定向筛查。运用Full MS/vDIA扫描模式，采用表2中真菌毒素特征碎裂片段的精确质量数提取并分析呈正态分布的色谱峰；比对真菌毒素的标准数据库信息，判断该物质的归属类别之后通过其质荷比、同位素丰度比、片段丰度比等质谱信息及碎裂途径，推断其元素组成和分子结构式。最后利用标准物质的色谱质谱信息进行确证和定量。目标物浓度由乳制品中真菌毒素化合物与标准物质的峰面积比乘以标准物浓度计算而得。例如，在筛查乳及其制品中的真菌毒素时运用外源性风险物质特征碎裂片段m/z494.348 25提取出呈正态分布且在标准信息库中没有的色谱峰(其质谱图见图3)。通过质荷比、同位素丰度比、片段丰度比信息推断该物质分子式为CxHyNOz,将丰度较高的片段与真菌毒素标准信息库的其他化合物断裂途径进行对比，发现该未知化合物与伏马毒素B2、伏马毒素B3的碎裂片段断裂机理相似(图4)，通过对谱图与标准物质比对分析，判断该化合物为伏马毒素B1，最终定量浓度为0.11 μg/kg。

2.3 基质效应

乳制品基质复杂，在电喷雾离子化模式下化合物的质谱响应易受基质干扰，因此实验通过绘制纯溶剂标准溶液和空白基质提取液匹配标准溶液的标准曲线来判断基质效应的强弱。基质效应按公式计算：C%=(1-Ss/Sm)×100；式中，C%为基质效应；Ss为纯溶剂配制的目标化合物标准曲线斜率；Sm为空白基质配制的目标化合物标准曲线的斜率。|C%|在20%以内为较弱基质效应，在20%～50%为中等基质效应，50%～100%为强基质效应。结果显示，38种真菌毒素中大部分化合物存在基质效应，其中10.5%属于中等强度的基质效应，86.8%为较弱基质效应，其余的少数真菌毒素属于强基质效应。为尽量降低基质效应干扰，建立校准曲线时，混合标准溶液采用基质匹配法配制，以最大限度地消除基质效应对于灵敏度和准确性的影响。

2.4 方法学考察

方法学参数依据欧盟标准2002/657/EC[26]与SANCO/12571/2013[27]。结果表明，检测方法中外源性风险物质在各自浓度范围内呈良好的线性，相关系数(r2)均大于0.99。本实验中检出限与定量下限通过确定限(CCα)和检测容量(CCβ)进行考察和表征。CCα指等于和高于此值时，用α误差概率计算得出，认为所测样品不符合规定的结论限度；CCβ指用β误差概率检测、鉴别、定量得到的样品中物质的最低含量，CCβ数值等于CCα取值时重现性标准偏差的1.64倍与CCα数值之和。CCα采用校准曲线法测定，向乳及乳制品基质中等距离梯度添加真菌毒素混合标准物质，分别以添加浓度与峰面积为坐标绘图，CCα数值为可观察到响应时纵坐标轴上的浓度值与对应的重现性标准偏差的2.33倍之和。计算得CCα和CCβ分别为0.01～0.36 μg/kg与0.03～0.57 μg/kg。在基质中添加低、中、高3个水平的真菌毒素系列混合标准物质溶液，经样品前处理后，运用四极杆-轨道离子阱质谱检测，计算得平均回收率与相对标准偏差(RSD)分别为81.9%～111%和1.1%～6.1%(表3)，所建立的方法准确性和精密度良好。

表3 巴氏杀菌乳中38种真菌毒素的线性范围、确定限、检测容量、相关系数、平均回收率及相对标准偏差(n=6)Table 3 Linear ranges,decision limits,detection capabilities,correlation coefficients(r2),recoveries and RSDs of 38 mycotoxin in pasteurised milk(n=6)

2.5 实际样品检测

采用所建立的方法筛查40个批次巴氏杀菌乳、超高温瞬时灭菌乳、含乳饮料与婴幼儿配方乳粉中的真菌毒素，其中一个巴氏杀菌乳样品中检出伏马毒素B1，含量为0.11 μg/kg，未超过我国国家限量标准《GB 2761-2017 食品安全国家标准 食品中真菌毒素限量》[28]。

3 结 论

本文建立了基于超高效液相色谱-四极杆-轨道离子阱质谱技术的乳制品中常见真菌毒素的快速识别和定量方法，使用dd-MS2与vDIA两种二级扫描模式分析了真菌毒素特征断裂片段，获得了真菌毒素标准数据库并完成裂解途径解析和特征碎裂片段筛选，获取了可追溯的样品质谱信息，最终实现了乳制品中真菌毒素的非定向筛查。方法学考察及实际样品的检测证明该方法具有灵敏度高、选择性强、质量精确度高的特点，方法的检出限、回收率及精密度满足国内外标准的要求，适用于多组分真菌毒素低含量残留的定量检测与定性确证，能够为企业及相关安全监管部门提供有力的技术支撑。