Slit2蛋白在胆囊癌中的表达及其临床意义

梁刚 王智翔 何盟国 杨学超 郭栋△

(1.陕西核工业二一五医院 普通外科;2.病理科， 陕西 咸阳 712000)

神经导向因子Slit是一种分泌性糖蛋白，可通过结合神经细胞膜上的Roundabout(Robo)受体家族发挥生物学功能。现有研究发现Slit/Robo信号通路除了能够诱导神经元轴突(或胞体)迁移外，还参与了肿瘤的发生、发展[1,2]。胆囊癌是胆道系统的恶性肿瘤，有关Slit/Robo信号通路在胆囊癌发生发展中的作用报道甚少，本研究通过测定Slit2蛋白在胆囊癌组织中的表达情况，分析Slit2蛋白与胆囊癌患者临床特征及预后之间的关系，以期了解Slit /Robo信号通路对胆囊癌发展的作用。报告如下。

1 材料与方法

1.1一般资料 选取陕西省核工业二一五医院 2008年1月至2015年12月间行胆囊癌手术治疗的石蜡包埋标本80例，其中男性34例， 女性46例， 平均年龄(62±3.25)岁，临床分期参照第八版外科学教材(2014年)胆囊癌 TNM 分期：Ⅰ期 14例、Ⅱ期 26例、Ⅲ期 35例、Ⅳ期 5 例；伴淋巴结转移者 38 例；组织学类型分类:腺癌 68例， 鳞癌 12 例。所有病例术前均未接受化放疗，术后经病理组织学证实为胆囊癌。另取80例相应癌旁组织作为对照组，癌旁组织均取自距肿瘤边缘 2 cm 以上无肿瘤组织。

1.2主要试剂 兔抗人Slit2多克隆抗体购自武汉博士德公司， SABC即用型免疫组化试剂盒、DAB显色试剂盒购由武汉博士德公司提供。

1.3方法

1.3.1实验方法 采用免疫组织化学法，切取80例胆囊癌组织及癌旁组织石蜡标本，切片厚度4 μm，将石蜡切片脱蜡至水化；3% H2O2去离子水室温孵10 min；PBS冲洗(5 min × 3次)；微波修复(0.01 mol/L枸橼酸盐，pH 6.0) 20 min；PBS冲洗(5 min × 3次)；5%BSA封闭液37 ℃孵育30 min，甩干；滴加一抗 4 ℃过夜(Slit2 浓度为1∶50)；PBS冲洗(5 min × 3次)；滴加生物素标记的二抗；PBS冲洗(5 min × 3次)；滴加SABC液；PBS冲洗(5 min × 3次)；DAB 显色，苏木精复染，脱水、透明、封片，每批实验以PBS液代替一抗作为阴性对照。

1.3.2Slit2蛋白结果判断 阳性染色为细胞质内出现棕色颗粒状，Slit2染色评估是根据每张切片阳性细胞染色强度及阳性细胞百分数进行分级。染色强度分4级：不着色为与背景一致，记为0分；弱染色为淡黄色略高于背景，记为1分；中度染色为黄色，明显高于背景，记为2分；强染色为棕褐色，记为3分。阳性细胞面积同样分4级：0%～11%记0分、11%～26%记1分、26%～51%记2分、51%～100%记3分。两项指标分数相加，总积分为0～2为阴性，3分及以上为阳性表达。

1.3.3生存随访 通过患者住院记录在案的电话进行随访，生存时间以手术时间为起点， 2018年12月31日为随访时间终点，共随访 68例，失访12例。随访患者最短生存时间2月，最长生存时间85月。

1.4统计学方法 应用SPSS19.0统计软件进行数据分析，计数资料以例数或率(%)表示，组间比较采用χ2检验；生存分析采用Kaplan-Meier法，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1胆囊癌组织及癌旁组织中Slit2的蛋白表达情况 胆囊癌组织中Slit2阳性表达率为57.5%，癌旁组织中Slit2阳性表达率为35.0%。两者均表现为细胞胞质内出现黄色颗粒或团块，见图1、图2；与癌旁组织相比，Slit2蛋白的表达明显增高，差异有统计学意义(χ2=8.457，P<0.05)。见表1。

图1 Slit2在胆囊癌组织中阳性表达 ×100

图2 Slit2在癌旁组织中阳性表达 ×100

表1 胆囊癌及癌旁组织中Slit2蛋白表达情况(n)

2.2Slit2蛋白表达水平与胆囊癌患者临床病理特征的关系 胆囊癌TNM分期及淋巴结转移患者的Slit2蛋白表达水平差异有统计意义(P<0.05) ；患者年龄、性别、胆囊癌病理类型、有无胆囊结石等特征与Slit2蛋白水平的差异均无统计学意义 (P>0.05) 。见表2。

表2 Slit2蛋白表达水平与胆囊癌临床病理特征的关系(n)

2.3Slit2蛋白表达水平与胆囊癌患者预后的关系 生存分析显示：Slit2阳性表达组及Slit2阴性表达组的胆囊癌患者术后 3 年生存率分别为 45.5%和64.3%，两组的中位生存时间分别为：12.0个月和30.0个月，Slit2阳性表达组的患者总生存期明显低于阴性表达组，差异有统计学意义(χ2=5.229，P=0.022)。

图3 Slit2蛋白阳性表达组及阴性表达组的生存曲线

3 讨 论

Slit蛋白家族是由基因 4p15.2 编码的大分子量的细胞外分泌蛋白，有Slit1、Slit2、Slit3 3个成员，通过结合跨膜蛋白Robo受体发挥生物学效应。目前研究发现，在Slit/Robo信号通路中，配体Slit蛋白主要通过其结构内富含亮氨酸的重复序列(leucine-rich repeat,LRR)结合受体Robo胞外前两个免疫球蛋白结构域样功能区(lg1、lg2)样功能区，激活Robo受体胞内区域，使其与下游效应物质如：小Rho GTPases等相互作用，发挥复杂的生物学功能[3,4,5]，如神经轴突导向、白细胞趋化性反应[6]、心管的形成[7]、肿瘤的发生发展[8,9,10]、血管损伤及生成[11,12,13]]等。

目前研究发现Slits在多种肿瘤中表达升高，有学者[14]报道Slit2在鳞状胃癌、肝癌、恶性黑色素瘤、直肠粘液腺瘤等常见肿瘤中有表达。Slit2在恶性黑色素瘤系A375细胞中表达上调，而受体Robo1表达于肿瘤血管内皮细胞上，有学者推测Slit2/ Robo1信号通路参与了恶性黑色素瘤的发病。Slit2、Robo1蛋白在分化状态差的晚期肝癌细胞上表达上调，通过测量Slit2、Robo1的表达情况可预测肿瘤分期和分化状态[15]。Slit2、Robo1在小肠癌中过度表达，激活Slit2/Robo1信号通路可诱导小肠粘膜癌变，并通过活化Src信号，下调E黏连蛋白，进而激活Wnt/β-catnin 途径，促进小肠肿瘤的发生发展[16]。在一些肿瘤中，Slit2在表达上没有明显变化，而其受体Robo1在直肠癌细胞中表达水平明显上调[17]。近年来，关于Slit/Robo信号通路与恶性肿瘤关系的研究越来越受人们重视，但Slit/Robo信号通路与胆囊癌的研究在国内外报道较少。

本研究发现，Slit2 蛋白主要分布于细胞胞质，并且高表达于胆囊癌组织中，差异有统计学意义(P<0.05)，提示胆囊癌中可能存在Slit/Robo信号通路，并且该通路对胆囊癌的发生发展有一定作用。另外，Slit2蛋白在TNM分期较晚、有淋巴结转移的胆囊癌组织中表达升高,差异有统计学意义(P<0.05)，提示Slit/Robo信号通路可能参与了胆囊癌的侵袭及转移。通过生存分析发现Slit2阳性表达组患者生存期明显低于Slit2阴性表达组患者，提示Slit/Robo信号通路可能与胆囊癌患者的生存期密切相关。Y.Shao等[18]研究发现胆囊癌中Slit、Robo1在表达升高，Slit表达与胆石症和肝脏受累有关，Robo1表达与肝脏受累和病理分期有关，并且Slit表达是Robo1表达的独立预测因子，尽管我们的研究与Shao等部分结果不一致，但都说明了Slit/Robo信号通路可能对胆囊癌的发生发展有一定作用。

综上所述，Slit2蛋白与胆囊癌侵袭、转移及与预后密切相关，Slit2蛋白可能通过Slit/Robo信号通路参与了上述生物学行为，其具体作用及机制仍需要进一步深入研究。