血清miR-122和miR-199a对子宫内膜异位症的诊断价值分析

王悦菲 蔡蓉 何琳△ 胡涛

(1.南京医科大学附属无锡第二人民医院妇科,江苏 无锡 214000；2.南京市妇幼保健院妇科,江苏 南京 210000)

子宫内膜异位症是一种慢性妇科疾病，是指有活性的内膜细胞种植在子宫内膜以外的位置而形成的一种女性常见妇科疾病[1]。5%～10%的育龄妇女存在子宫内膜异位症，其中有80%的患者甚至影响到生育问题[2]。目前子宫内膜异位症确诊金标准是腹腔镜，这是一种高度侵入性的操作，存在许多潜在的医疗风险[3]。因此在不影响病人治疗的前提下要尽量避免腹腔镜手术，就有必要寻找可靠的非侵入性诊断方法来诊断该疾病。miRNA有重要的靶基因[4]，其表达也影响子宫内膜异位症等多种生理和病理状态。正常子宫内膜组织和子宫内膜异位症患者子宫内膜组织中几种miRNA及其靶基因的表达存在差异[5]，而微阵列分析可以检测这些miRNA在子宫内膜中的差异表达[6]。因此miRNA在子宫内膜异位症患者中的差异表达，通过血清中循环miRNA的检测可能具有较高的诊断价值[7]。子宫内膜异位症妇女的炎症标志物的测定还没有明确的研究结论。除了miRNA水平，一些研究还证实患病妇女和健康妇女之间的血清白细胞介素6(Interleukin-6,IL-6)之间没有差别，而有研究报告指出在子宫内膜异位症妇女中IL-6水平较高[8]。子宫内膜异位症的生物标志物如果能在血液或其他体液中检测，如腹膜液、月经和子宫内膜液，将极大降低子宫内膜异位症患者诊断的难度。本研究的目的是评价血清和腹膜液的miR-122、miR-199a和IL-6作为诊断子宫内膜异位症的可靠无创生物标志物的效能。报告如下。

1 资料和方法

1.1一般资料 选取2016年1月至2018年1月在我科住院的患者共计150例。纳入标准：(1)所有盆腔子宫内膜异位症，经腹腔镜诊断并经组织病理学检查证实的患者。(2)对照组的对象是因盆腔疼痛、不孕症或良性肿瘤接受腹腔镜手术但未被诊断为子宫内膜异位症的妇女。排除标准:在腹腔镜手术前3个月内因子宫腺肌病、子宫内膜癌、子宫内膜增生、子宫内膜息肉、慢性或急性炎症疾病、传染病、恶性肿瘤、自身免疫性疾病和心血管疾病等接受过药物治疗的患者。

1.2方法

1.2.1所有参与者都接受了完整的检查，包括月经模式的评估、全身和腹部检查、局部盆腔检查以及腹腔镜检查子宫内膜异位症的存在与否。

1.2.2手术前，在卵泡期(5～10 d)采集血液样本：样本在37 ℃下孵育15 min，离心15 min分离血清，-80 ℃保存。测定白细胞介素-6、miR-122和miR-199a水平，在腹腔镜检查时抽取腹腔积液：离心20 min取腹腔液中的细胞成分，在-80 ℃下保存上清液，测定IL-6、miR-122和miR-199 a水平，通过酶联免疫吸附测定白细胞介素-6的浓度。

1.2.3RNA的提取是使用mirVana Paris Kit进行，含RNA的洗脱液在-20 ℃保存。

1.2.4通过聚合酶链反应(PCR)分析，定量实时检测miR-122和miR-199 a的表达。以U6 RNA为内源对照，在42 ℃下处理20 μL RNA 1 h，在93 ℃下处理3 min，再用miRNasy血清反转录试剂盒进行反转录。逆转录产物(cDNA)保存在4 ℃。

1.2.5在PCR中，10 μL稀释cDNA，12.5 μL SYBR原料，0.5 μM每个特异引物和超纯水，总体积为25 μL。采用7800实时聚合酶链反应系统进行实时PCR反应，其热循环参数为：95 ℃，10 s；57 ℃，30 s；75 ℃，30 s35个循环之后，再95 ℃，5 min。

1.2.6用循环阈值(CT)法定量miRNA的表达水平，CT定义为荧光信号跨过检测阈值所需的周期数。从所研究的miRNA的CT值中减去U6RNA的CT值，计算参考样品和靶标本的CT值。然后使用得到的标准化ΔCT值WER计算2-ΔCT的相对表达值。

1.3统计学方法 用SPSS软件16.0进行统计分析。各组间比较采用χ2检验，t检验和方差分析。进行Pearson相关分析，以检验变量之间的相关性。ROC曲线分析，检测血清和腹腔液miR-122和miR-199a的最佳临界值。计算曲线下面积(AUC)以评价诊断试验的准确性，AUC为0.90～1.00为优，0.80～0.90为良，0.70～0.80为一般，0.80～0.60为不合格，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1一般资料的比较 本研究包括80例盆腔子宫内膜异位症(8例合并深浸润性疾病)和70例无子宫内膜异位症的妇女。两组在年龄、体重指数、盆腔疼痛、痛经或月经异常方面差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。

表1 研究组的临床特征[n(%)]

2.2实验组和对照组比较 子宫内膜异位症患者血清和腹腔液中IL-6、miR-122和miR-199 a水平明显高于对照组，差异有统计学意义(P<0.001)。见表2。

表2 研究组血清和腹腔液IL-6、miR-122和miR-199 a的水平

不同时期子宫内膜异位症患者血清和腹腔液中miR-122和miR-199 a水平差异无统计学意义，提示miR-122和miR-199 a水平与子宫内膜异位症分期无关。见表3。

表3 标记物与子宫内膜异位症分期的关系

血清miR-122和miR-199a检测子宫内膜异位症的敏感性分别为96.6%和100.0%，特异性分别为94.4%和100%。血清miR-122与IL-6(血清和腹膜液)、miR-199 a(血清和腹膜液)呈正相关，所有相关性差异有统计学意义(P<0.001)。血清miR-199 a与IL-6(血清和腹腔液)、miR-122(腹腔液)差异有统计学意义(P<0.001)。见表4。

表4 血清miR-122和血清miR-199 a与其他标记物的相关性

ROC曲线(图1)分析显示血清miR-122和miR-199a对子宫内膜异位症有较高的诊断价值(表5)。

图1 miR-122(左)和miR-199a(右)的特异性及敏感性分析

表5 血清miR-122和miR-199 a的ROC曲线分析

3 讨 论

目前，子宫内膜异位症主要由腹腔镜诊断和评估[9]。因此在疾病的早期阶段，由于缺乏症状和敏感的生物标志物，其检测和治疗往往被延误[10]。在本研究中，子宫内膜异位症患者血清和腹膜中miR-122、miR-199 a和IL-6水平明显高于对照组，提示这些分子可作为诊断子宫内膜异位症的生物标志物。国内有研究表明90%的妇女有月经逆行，但并非所有的妇女都有子宫内膜异位症[11]。这一事实表明子宫内膜异位症患者的子宫内膜在分子水平上的表达可能存在差异。这些分子差异可能会导致部分妇女患上子宫内膜异位症[12]。如果这些差异确实是子宫内膜异位症的病理改变，则参与分子可能成为腹腔镜组织活检的重要生物标志物。

miRNA在多种生理和病理条件下起着至关重要的作用[13]。血浆miRNA谱改变已检测到存在于各种类型的癌症，包括实体肿瘤，白血病，B细胞淋巴瘤，卵巢癌，以及糖尿病和肝硬化[14,15]。由于血清标志物检测方法简单、便于测量，检测血清特异性循环miRNA水平的变化有助于子宫内膜异位症的诊断。事实上许多miRNA被认为在子宫内膜异位症中起着一定的作用[16]。且miRNA作为检测子宫内膜异位症的生物标志物是一个相对较新的研究领域，目前研究血清或血浆miRNA预测值的研究还很少[17]。

综上所述，本研究显示与对照组相比子宫内膜异位症患者血清、腹膜液中的miR-122和miR-199a水平显著升高。因此，这些miRNA在子宫内膜异位症的诊断中具有作为生物标志物的潜力。疾病早期非侵入性检测这些标记物，成本和对患者的创伤远远低于现有的方法。而目前已证实这些标记物在的血清水平与腹膜水平相比具有相关性，最终可以避免通过腹腔镜手术抽取腹腔液。除本研究外，还可以进一步研究血清中其他的miRNA，进而找到更为合适的分子标记物，明确相关分子标记物诊断子宫内膜异位症的金标准。