老年db/db小鼠生存状态的评价研究
2020-07-02郝云涛徐美虹
樊 蕊 郝云涛 徐美虹 李 勇
糖尿病是由多种因素引起的代谢性疾病，严重威胁人类的生命健康和生活质量。2型糖尿病以胰岛素抵抗和胰岛β细胞功能减退为特征，与遗传因素和环境因素密切相关，在临床上主要表现为多饮、多尿、多食及体重减少。随着社会发展和人们生活水平的提高，2型糖尿病的发生率呈现逐年上升的趋势，在发达国家糖尿病并发症引起的死亡人数已经跃居继心脑血管疾病、癌症之后的第3位[1]。
动物疾病模型的研究是人类疾病研究的基础，目前2型糖尿病小鼠模型主要包括自发性糖尿病小鼠、诱导性糖尿病小鼠、转基因及基因敲除小鼠。自发性糖尿病小鼠模型是指未经任何有意识的人为处置，在自然条件下发生糖尿病的小鼠模型，其优点为模型小鼠糖尿病的发生、发展进程与人类T2DM 相似，具有较高的应用价值。其常见的模型有ob/ob小鼠、db/db小鼠、KK-Ay小鼠、新西兰肥胖小鼠、NSY小鼠、TSOD小鼠、M16小鼠，且各模型均有其优势及局限性[2]。
db/db 小鼠是从 C57BL/6J 小鼠中筛选出的一株突变系，该小鼠由于常染色体隐性遗传的瘦素受体基因缺陷，导致具有自发糖尿病特性，纯合子(db/db)小鼠表现为肥胖及多饮、多食等症状。这种小鼠的发病过程与人类 2 型糖尿病表现极为相似，是研究人类 2 型糖尿病的理想动物模型[3]。
目前研究者对于db/db小鼠生命特征的研究多集中在20周龄以下，而对于老年db/db小鼠生命特征和生存质量并未见报道，同时对于该模型小鼠的实际寿命的报道结果不一。在对糖尿病以及糖尿病老年患者的研究中，老年糖尿病患者的生存状态是研究领域中的关键问题和难点问题。本研究对db/db小鼠喂养终生，对其老年期间的生存状态以及生存质量予以探析，以期对充分恰当的应用该模型小鼠提供理论依据，同时对如何提高糖尿病患者老年的生存质量提供思路和参考。
材料与方法
1.实验动物：10周龄db/db 型糖尿病小鼠(20只)及与之周龄、性别匹配的非糖尿病的健康同窝出生仔畜(db/m小鼠，20只)，体质量25±2g，饲养终生。由北京大学医学部实验动物中心提供，实验动物生产许可证号： SCXK(京) 2016-0010，屏障环境动物房[实验动物使用许可证号：SYXK(京)2016-0041]，SPF级动物房，饲养环境温度21～23℃，湿度50%～60%。以美国营养学会(AIN-93G)动物饲料作为基础饲料，所有动物自由饮水进食。待正常饲养至70周，进行各项指标的测定。
2.仪器：安稳血糖仪、安稳血糖试纸购自中国三诺公司; YLS-1A多功能小鼠自主活动记录仪购自济南益延科技发展有限公司。
3.动物一般状态观察及体格指标测定：每周观测并记录动物的活动度、毛发光泽、摄食量、饮水量、体质量。
4.尿液收集：正常饲养71、75、79、83周的小鼠置于代谢笼中，收集24h尿液，尿液采集后，立即混匀，测定体积。
5.脏器指数：各组小鼠饲养临近至寿命终点时，小鼠称重后脱颈椎处死，无菌快速分离肾周脂肪、睾周脂肪，剥离腓肠肌，称重；分别称取小鼠的心脏、肝脏、肾脏、脾脏、胸腺，计算脏器指数/脂肪系数。脏器/脂肪指数(%)=脏器质量(g)/体质量(kg)×100%
6.随机空腹血糖检测：每隔4周监测随机空腹血糖，测定前禁食6h，测定时剪尾取血，采用血糖仪测定及记录。
7.自主活动情况测定：分别将75周龄的db/db和db/m小鼠放入自主活动仪的活动箱内，先适应15min，再记录小鼠5min内活动次数和时间，然后取出小鼠。
结 果
1.老年db/db和db/m小鼠体质量和摄食量的变化：(1)老年db/db随着生长周龄的增加，其体质量呈现持续降低的趋势，从70周龄的79.2g 降至83周龄的73.0g，降幅为7.8%。而db/m小鼠体质量的变化大体恒定，仅从70周龄的44.2g 降低至濒死状态下的43.0g，但是在整个老年期，db/db小鼠整体体质量显著高于db/m小鼠(图1)。(2)在老年期间，db/db小鼠摄食量未呈现规律变化，而db/m摄食量呈现曲折下降的趋势，其整体摄入量始终低于db/db小鼠(图2)。
图1 老年db/db和db/m小鼠体质量的变化
图2 老年db/db和db/m小鼠摄食量的变化
2.老年db/db和db/m小鼠饮水量、尿量的变化：(1)从整体趋势看，老年期间db/db小鼠和db/m小鼠饮水量无明显变化，只是db/db 小鼠饮水量显著高于db/m小鼠饮水量(图3)。(2)两组老鼠尿量的变化情况与饮水量相似，整个老年期间，变化量不明显，但从整体而言，db/db小鼠尿量显著高于db/m小鼠，其尿量为db/m小鼠尿量的4倍(图4)。
图3 老年db/db和db/m小鼠饮水量的变化
图4 老年db/db和db/m小鼠尿量的变化
3.老年db/db和db/m小鼠自主活动情况：5min内db/m和db/db小鼠的自主活动次数比较，差异无统计学意义(P>0.05)，但db/m小鼠单次活动时长和累计活动时长均显著长于db/db小鼠(P<0.05)，分别为db/db小鼠的6倍和5倍(表1)。
表1 老年db/db和db/m小鼠自主活动
与db/m比较，*P<0.05
4.db/db和db/m小鼠脏器指数：临近寿命终点的db/db小鼠肝脏质量和胰脏质量>db/m小鼠，而db/db肾脏、脾脏以及睾丸质量均 表2 临近寿命终点db/db和db/m小鼠脏器质量 与db/m比较，*P<0.05 表3 临近寿命终点db/db和db/m小鼠脏器指数 与db/m比较，*P<0.05 5.db/db和db/m小鼠脂肪和腓肠肌系数：从小鼠的解剖情况下看，临近寿命终点的db/db小鼠其体型明显>db/m小鼠，而且其皮下脂肪显著多于db/m小鼠，db/m小鼠的肾周脂肪和睾周脂肪的比重均显著>db/m小鼠(P<0.05)，而其腓肠肌比重显著低于db/m小鼠(P<0.05,图5)。 图5 db/db和db/m小鼠临近寿命终点脂肪和腓肠肌指数与db/m比较，*P<0.05 6.老年db/db和db/m小鼠血糖变化情况：老年期间db/db小鼠的血糖随着生长周龄的增加呈现降低的趋势，而db/m小鼠血糖则呈现微小增加趋势，整体来看，db/db小鼠血糖高于db/m小鼠，其中71周龄和75周龄db/db小鼠血糖显著高于db/m小鼠(P<0.05，图6)。 图6 老年db/db和db/m小鼠的血糖变化情况与db/m比较，*P<0.05 7.db/db和db/m小鼠存活率：随着小鼠生命的延续，其存活率呈现下降趋势。<81周龄，db/db和db/m小鼠的存活率恒定，分别为100%和73%，但高于81周龄后，db/m小鼠开始出现死亡现象，而db/db小鼠则出现了大量死亡的现象，截止83周，其生存率仅为20%，84周其生存率下降至0(图7)。 图7 db/db和db/m小鼠存活率 db/db小鼠主要表现为下丘脑缺陷，它不能产生饱感，即对饱感物质(瘦素)缺乏反应，从而合成代谢大于分解代谢，引起脂肪的堆积而肥胖，逐渐发展为严重的糖尿病伴有明显的高糖血症。该小鼠具有和人类2型糖尿病相似的临床症状，多饮、多食、多尿、肥胖、高血糖、高胰岛素血症、胰岛素抵抗、脂代谢异常等综合征[3～5]。图1显示db/db小鼠体质量显著高于对照db/m小鼠，而图5也显示，db/db小鼠其皮下脂肪远远多于db/m小鼠，且肾周脂肪和睾周脂肪含量也显著高于db/m小鼠。图1～图4显示，db/db 小鼠的摄食量、饮水量以及尿量显著高于db/m小鼠，可见即使老年db/db小鼠仍然具有典型的多饮、多食、多尿、肥胖等症状。 相比于以往对集中在20周龄以下的db/db小鼠的研究，本研究更多地反映老年期db/db小鼠的生存质量和生命特征，并且根据以往报道的db/db小鼠10个月的生存寿命，研究在正常饲养条件下，70周龄以后的db/db小鼠的生存状态。 动物衰老时，由于构成机体的主要物质如蛋白质、核酸、脂肪的代谢率下降，合成量少于分解量，结构物质不断损耗，细胞间及细胞质中的水分失去依托也逐渐丧失，导致其体质量不断下降。图1显示老年db/db随着生长周龄的增加，其体质量呈现持续降低的趋势， 而db/m小鼠体质量的变化大体恒定。当步入老年，体力出现明显下降，这是由于骨骼肌中蛋白质合成量不足，细胞结构破坏后氧化磷酸化功能受损，ATP合成减少所致[6]。同时，神经肌肉系统的功能和表现也出现衰退，其表现为骨骼肌质量的下降和肌力减退。有文献报道，糖尿病模型鼠，自主活动明显减少，行动迟缓，伴有颤抖现象[7]。本实验对db/db小鼠的自主活动进行了评价，db/m小鼠单次活动时长和累计活动时长均显著长于db/db小鼠(P<0.05)，分别为db/db小鼠的6倍和5倍。两者的腓肠肌含量比较，差异有统计学意义(P<0.05，图4)。 衰老的因素很多，部分研究者认为免疫系统结构老化与功能下降是衰老的主要原因与标志。实验动物脏器质量和脏器系数是鉴定动物遗传品质的重要依据, 动物内脏器官的质量、脏器系数是许多生物医学研究中常用的重要数据[8]。本研究通过对临近寿命终点的db/db和db/m小鼠的脏器进行分析发现，临近寿命终点的db/db小鼠的肝脏指数>db/m小鼠，而db/db小鼠的肾脏指数、脾脏指数、胰脏指数和睾丸指数均 研究表明，脾脏作为外周免疫器官，随着年龄增加而逐渐减小，性质发生改变。其代谢也随之减弱，这可能导致免疫功能降低。因此，脾脏的萎缩，代表机体免疫功能减弱，可加速衰老进程[11]。Homo-Delarche等[12]研究报道糖尿病动物模型会出现胰岛增生肥大的病理改变，7月龄db/db纯合仔小鼠胰腺体积较大，胰岛中均见淋巴细胞浸润；12月龄db/db小鼠胰腺部分胰岛内及其周围组织有灶性淋巴细胞浸润，部分胰岛内见较多小导管样病变，胰腺小导管病变有增生扩张及潴留，使得胰岛细胞之间间隙增宽[13]。本研究也发现db/db胰腺质量>db/m小鼠。另外，本研究中db/db小鼠睾丸的质量 据文献报道，db/db小鼠从4周龄即出现贪食，产生可以辨认的肥胖表型。出生后10～14天，血浆胰岛素和血糖开始升高，并出现多饮、多食、多尿的症状，其发病过程与2型糖尿病患者非常相似[14]。纯合子db/db小鼠在早期发育阶段，甚至于在3～4周龄时即显现糖尿病征兆。>8周龄的db/db小鼠，其血糖值已经持续在20mmol/L以上，db/db小鼠的血糖值随年龄增大而逐步升高，当3～6月龄，血糖最高可达到35mmol/L以上，随后小鼠的体质量开始逐渐减轻，7月龄的db/db小鼠其血清血糖水平为15mmol/L[15]。本研究中老年db/db小鼠的血糖水平显著高于db/m小鼠，但是随着生长周龄的增加，db/db小鼠的血糖水平呈现微小降低的趋势，从70周龄空腹血糖11.0mmol/L下降至79周龄的8.5mmol/L[16]。目前虽然未有报道老龄db/db血糖变化情况，但其变化趋势与文献预测相似。>6月龄的db/db小鼠随着月龄增加，其血糖随之降低，最后直至发病致死[15]。 关于db/db小鼠寿命的报道显示，纯合子糖尿病小鼠db/db于3～8周龄时开始贪食及发胖，体质量增重加速，继而产生高血糖、高血胰岛素，胰高血糖素也升高，属于肥胖型高血糖糖尿病模型。一般在10个月内死亡，其平均寿命约6～8个月，但也有个别报道，其可以活到12月龄[13]。本研究发现，<81周龄，db/db和db/m小鼠的存活率恒定，分别为100%和73%，但高于81周龄后，db/m小鼠开始出现死亡现象，而db/db小鼠则出现了大量死亡的现象，截止84周其生存率急剧下降至0。 目前报道中尚未发现db/db小鼠存活时间>60周龄，本研究发现，即使不经过任何干预，自然生长的db/db小鼠70月龄的生存率为72%，db/db小鼠寿命远大于相关文献的报道，分析其原因，(1)与目前存在的早期报道的db/db小鼠寿命比较，早期实验饲养环境可能会影响其寿命。(2)近年来未有文献专门研究db/db小鼠的生存年限，仅有极少数文献有报道，在严格的饲养条件下，饮用水为消毒酸化水，饲养用具严格灭菌，饲养温度20～26℃，湿度为50%～70%，db/db小鼠可以安全存活至12月龄。12月龄的小鼠仅表现为一些组织病理学的改变，如部分胰岛内及其周围组织有灶性淋巴细胞浸润，可见小导管样病变，胰腺小导管病变有增生扩张及潴留。肾脏中肾小球细胞数目、系膜基质增多，系膜细胞增生[13]。 综上所述，老年db/db小鼠的生命体征和生存质量需要深入研究，并且db/db小鼠寿命的延长机制值得进一步探讨，将在后续实验中开展进一步延长寿命的营养干预措施研究。
讨 论
