基于PI3K/Akt/NOS通路探讨鞣花酸在脑缺血再灌注损伤大鼠的神经保护作用

翟锴华 娄季宇

1)郑州大学第一附属医院，河南 郑州 450052 2)郑州大学第二附属医院，河南 郑州 450003

脑卒中最常见的类型为缺血性卒中，目前认为血管再通是治疗缺血性卒中的最有效方法，但是缺血后的再灌注损伤是影响治疗效果的主要因素，其发生机制十分复杂，涉及一系列级联反应。鞣花酸是一种天然的植物化学物，具有抗突变、抗氧化应激及诱导肿瘤细胞凋亡等作用。研究发现鞣花酸可以减轻缺血再灌注损伤，但具体机制仍不明确。磷酸化激活的PI3K/Akt信号通路参与脑缺血再灌注后氧化应激、细胞凋亡、血管生成等多个生理、病理过程[1]，活化的PI3K/Akt/NOS通路可能是鞣花酸对脑缺血再灌注损伤大鼠发挥神经保护作用的药理机制。因此本文在脑缺血再灌注大鼠模型中探讨鞣花酸预处理对PI3K/Akt/NOS通路的作用。

1 材料与方法

1.1实验动物及分组雄性Wistar大鼠36只，体质量250～300 g均购自郑州大学实验动物中心，遵循郑州大学医学院实验动物保护和使用准则。实验中动物饲养于郑州大学SPF级动物实验室。按随机数字表法分为假手术组(Sham，n=12)、缺血再灌注组(IR，n=12)及鞣花酸预处理组(EA，n=12)。鞣花酸溶于生理盐水中配置成混悬液，连续每天给予鞣花酸预处理组大鼠100 mg/kg的鞣花酸灌胃，假手术组和缺血再灌注组大鼠同等体积的生理盐水灌胃。

1.2主要试剂及器材线栓(北京西浓科技有限公司)，小动物手术显微镜(Carl Zeiss公司，德国)、离心机(Thermo Fisher Scientific 公司，瑞典)、显微镜(Nikon公司，日本)等。cleaved caspase-3、细胞色素C、Bax、Bcl-2、Akt、p-Akt、eNOS、p-eNOS抗体购自 Cell Signaling Technology (CST)。EA(上海源叶生物科技有限公司)，HE 染色试剂盒购自碧云天，切片机(型号：CM3050S，德国Leica公司)，BCA试剂盒及TBTS购自Sigma公司，ImageQuantTM 400凝胶成像系统(美国通用)。

1.3脑缺血再灌注模型的制作及评价参照改良LONGA等[2]的造模方法制作大鼠缺血再灌注模型，腹腔注射3.6%水合氯醛(1 mL/100 g)，麻醉成功后，仰卧固定于鼠板上，分离左侧颈总动脉、颈内动脉、颈外动脉，结扎颈外动脉及颈总动脉的近心端，动脉夹夹闭颈内动脉，从颈总动脉远心端将线栓从颈总动脉分叉处送至颈内动脉(18±2)mm，阻断大脑中动脉血流，缝合切口并将线栓尾端固定于皮肤外面，缺血120 min后抽查线栓。参照LONGA评分法对麻醉清醒后的大鼠进行评分，选取1～3分的大鼠为本实验的动物模型。

1.4HE染色各组大鼠神经功能缺损进行评分后随机选 6 只大鼠麻醉后处死，分离脑组织，剪取缺血侧脑组织约 0.5 g 储存在-80 ℃备用。剩余组脑织严格按照操作规范经蜡包埋，制作病理切片。之后参照说明书步骤以苏木素及伊红染色，然后在光学显微镜下选取 5 个视野进行观察并采集图像。

1.5Westernblot方法检测凋亡相关蛋白及PI3K/Akt/eNOS信号蛋白的表达在冰上将脑组织剪碎后加入蛋白裂解液，制作为匀浆液后3 000 r/min，离心 20 min后取其上清液，BCA 试剂盒测得蛋白总浓度，具体操作步骤及流程严格按照说明书进行，取各组中等质量的样品液DS-PAGE电泳，湿转法转膜，5%脱脂牛奶封闭，将膜置入一抗(Bax 1：1000，β-actin 1：1000)，于4 ℃孵育过夜后TBST清洗3次后加二抗，室温孵育2 h，TBST 漂洗3次，加入ECL化学发光液显色，用Image J软件灰度值(DPI)分析。同样步骤检测CytC、Cleaved caspase-3、Bcl-2、p-Akt、Akt、p-eNOS、eNOS表达。

1.6统计学处理本研究中所有数据用SPSS 18.0进行统计分析，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验。P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1各组大鼠NSS评分与假手术组比较，模型组大鼠NSS评分显著升高，差异具有统计学意义(P<0.05)；与模型组比较，鞣花酸预干预组大鼠的NSS评分显著下降，差异具有统计学意义(P<0.05，图1)。

注：*与Sham组比较，&与IR组比较，P<0.05图1 鞣花酸对脑缺血再灌注损伤大鼠神经系统严重程度评分的影响Figure 1 Effect of ellagic acid on neurological severity score in rats with cerebral ischemia-reperfusion injury

2.2脑梗死区神经元形态的变化高倍镜下各实验组的大鼠皮层的组织学观察结果，如图1所示：假手术组缺血区皮层细胞数量较多，形态正常；模型组细胞数量减少，细胞形态异常，胞浆中可见一个或者多个空泡，基质疏松，可见较多的深染的凋亡小体及坏死细胞；鞣花酸预处理组神经元正常结构消失但大体形态存在，神经元皱缩较模型组程度低(图2)。

2.3各组大鼠脑组织凋亡蛋白表达变化模型组cleaved caspase-3、细胞色素C和Bax表达量明显升高(P<0.05，图3)；鞣花酸组cleaved caspase-3、细胞色素C和Bax表达量明显下降(P<0.05，图3)。

2.4各组大鼠脑组织中PI3K/Akt/NOS信号通路相关蛋白表达变化模型组p-Akt/Akt和p-eNOS/eNOS的值明显升高，鞣花酸组p-Akt/Akt和p-eNOS/eNOS的值明显下降(P<0.05，图4)。

图2 鞣花酸对大鼠缺血再灌注脑损伤HE染色的影响(×400)

Figure1 The effect of EA on wistar rats with IR observed by HE staining (×400)

注：与假手术组比较，*P<0.05；与IR组比较，&P<0.05

图3 鞣花酸对大鼠脑皮层中cleaved caspase-3、细胞色素C、Bax/Bcl-2表达的影响

Figure 3 The effects of EA on protein expression of cleaved caspase-3，Cytochrome C，Bax/Bcl-2 in the cortex

注：与Sham组比较，*P<0.05；与IR组比较，&P<0.05图4 各组大鼠脑组织中p-Akt/Akt和p-eNOS/eNOS的比值Figure 4 The expression of p-Akt/Akt and p-eNOS/eNOS in the brain tissue of each group

3 讨论

缺血性脑卒中的再灌注可能诱发钙离子超载、炎症反应、氧化应激、凋亡过度等，进一步加重缺血再灌注区神经元损伤[3]，导致患者严重的残疾或甚至死亡的重要因素之一，因此探讨如何减轻脑缺血再灌注后损伤具有重大意义[4]。目前研究已发现，缺血再灌注损伤的发病机制涉及多个缓解：氧化应激、细胞内钙超载、炎症反应及凋亡等多种病理机制。虽然凋亡在维持机体内正常细胞群体数量稳态中发挥重要作用，但是在过分刺激或者不利的环境下，凋亡水平的改变会干扰正常细胞群体数量稳态，从而影响神经元的功能，甚至会出现细胞内正常蛋白或者细胞器的严重损伤，造成器官或者机体的损伤，此时凋亡演变为不良的反应，因此调控凋亡过程是防治疾病的一个途径[5-6]。

脑血管病预后及生存质量与神经功能缺损密切相关，因此在药物对脑缺血再灌注的作用研究中，运动行为学的判断至关重要。本试验中鞣花酸预处理组大鼠的NSS显著高缺血再灌注组，同时鞣花酸预处理后皮层细胞的数量及形态较模型组均有改善，提示鞣花酸预处理可以减轻缺血再灌注脑损伤程度，从而改善脑缺血再灌注损伤造成的神经功能缺损。同时鞣花酸来源于浆果类和坚果类，其来源广泛、低毒性和易获得等特点，因此鞣花酸在治疗缺血性卒中方面可能是一个很有前景的药物。因脑缺血再灌注损伤的发病机制复杂，而鞣花酸在脑缺血再灌注损伤中的作用及其机制目前仍不清楚。

为了进一步探讨机体内鞣花酸对凋亡水平调控的作用，本试验选择检测重要的凋亡蛋白的表达。脑缺血再灌注损伤后的有害线粒体反应已被证实[7]，线粒体释放促细胞凋亡因子进入细胞质，上调凋亡水平响神经元凋亡。在细胞凋亡途径中的线粒体凋亡途径中，细胞色素C的释放至胞浆，与凋亡诱导因子相互作用，进一步活化天冬氨酸蛋白水解酶(cysteinyl aspartate specific proteinase，Caspase)，Caspase-3是多种细胞凋亡途径的必经之路，在细胞凋亡中最关键的因素，Caspase-3接受凋亡信号后裂解为活性的cleaved caspase-3，调控下游凋亡蛋白，而Bcl-2具有抑制凋亡的作用，Bax/Bcl-2比值是判定细胞凋亡状态的重要标志。本试验中模型组大鼠脑组织中cleaved caspase-3、细胞色素C和Bax/Bcl-2明显升高，提示升高的cleaved caspase-3、细胞色素C和Bax/Bcl-2与脑缺血再灌注损伤有关，给予鞣花酸可以明显的降低cleaved caspase-3、细胞色素C和Bax/Bcl-2，推测鞣花酸可能抑制cleaved caspase-3相关的凋亡，从而降低大鼠缺血区的凋亡水平减轻缺血再灌注损伤。

本研究的目的是探讨脑缺血再灌注损伤大鼠中鞣花酸对PI3K/Akt/NOS通路调控及其神经保护作用。PI3K/Akt通路是机体内经典的促增殖、抗凋亡信号，激活的PI3K/Akt通路对于维持正常的凋亡水平，保证神经元正常功能具有至关重要的作用[8]。有文献报道PI3K/Akt信号通路参与电针对缺血脑组织的保护作用[9]。已有研究发现，在脑缺血再灌注损伤过程中PI3K/Akt 通路中的P-PI3K/PI3K和P-Akt/Akt升高，信号通路处于抑制状态，药物干预后激活 PI3K/Akt 信号，P-PI3K/PI3K和P-Akt/Akt下降，过度凋亡受到抑制，局灶性脑缺血再灌注损伤明显减轻[10]，因而目前认为在缺血性脑卒中中PI3K/Akt 通路是一个很有希望的治疗靶点。本试验中模型组P-Akt/Akt显著下降，提示缺血再灌注中P-Akt表达比例增加，信号通路处于抑制状态，同时促凋亡蛋白(cleaved caspase-3、细胞色素C和Bax/Bcl-2)表达增加，凋亡水平升高；而鞣花酸预处理组P-Akt/Akt显著升高，提示缺血再灌注中P-Akt表达比例下降，信号通路处于激活状态，同时促凋亡蛋白(cleaved caspase-3、细胞色素C和Bax/Bcl-2)表达下降，过度凋亡被抑制。从以上试验结果推测，激活该通路可抑制凋亡过度表达，减轻缺血再灌注损伤，鞣花酸在脑缺血再灌注损伤大鼠中的脑保护作用可能是激活PI3K/Akt 信号。与目前研究符合，丹酚酸通过调节PI3K/Akt信号通路抑制凋亡，减轻脑缺血再灌注损伤[11]。

Akt主要通过两种途径控制细胞凋亡，一种是通过TSC1/TSC2复合物和mTOR信号通路来调控细胞生长；另一种是作用于CDK 的抑制分子P21和P27，并间接影调控细胞周期和细胞增殖。NOS是合成NO的重要限速酶，作为PI3K/Akt信号通路中下游靶目标之一，在脑缺血再灌注损伤中发挥重要作用，缺血是诱导NOS表达增加的一个重要因素。适当浓度的NO对脑血流的调节十分重要，过多的NO与超氧阴离子形成具有强氧化能力的过氧亚硝酸，加重氧化应激损伤，表现出神经毒性作用。内皮型一氧化氮合酶(eNOS)是NOS三种亚型之一，在eNOS敲除小鼠的梗死面积明显增大，提示eNOS可能在脑缺血有一定的保护作用[12]。本实验显示，模型组P-eNOS/eNOS显著下降，提示缺血再灌注中P-eNOS表达比例增加，信号通路处于抑制状态，同时促凋亡蛋白(cleaved caspase-3、细胞色素C和Bax/Bcl-2)表达增加，凋亡水平升高；而鞣花酸预处理组P-eNOS/eNOS显著升高，提示缺血再灌注中P-eNOS表达比例下降，信号通路处于激活状态，同时促凋亡蛋白(cleaved caspase-3、细胞色素C和Bax/Bcl-2)表达下降，过度凋亡被抑制。从以上试验结果推测，eNOS作为PI3K/Akt信号通路中下游靶目标之一，参与激活该的通路从而抑制凋亡过度表达，减轻缺血再灌注损伤。

鞣花酸可激活PI3K/Akt/eNOS信号通路，抑制缺血再灌注损伤区神经元的凋亡，减轻脑组织损伤，减轻神经功能缺损，因此激活PI3K/Akt/eNOS通路可能是鞣花酸治疗缺血性卒中的药理机制之一。但是本研究目前只进行初步探讨，鞣花酸对PI3K/Akt通路的下游信号的调控机制涉及较少，需要进一步深入研究鞣花酸对在缺血再灌注损伤的保护作用机制。