吡虫啉在棉花上的残留消解动态及对意大利蜂的急性毒性

李世奎，范继文，宁忠雄，路 伟

(新疆农业大学农学院/棉花教育部工程研究中心，乌鲁木齐 830052)

0 引 言

【研究意义】新疆棉花种植面积占全国种植面积的74.3%，已成为国内棉花供给的重要支柱[1-2]。随着烟碱类杀虫剂在新疆农业的广泛使用，吡虫啉等传统烟碱类杀虫剂对环境中非靶标生物尤其是传粉昆虫蜜蜂的安全性成为关注的焦点。【前人研究进展】剧晓青等[3]研究了吡虫啉在茶叶的残留分析方法及残留动态，研究表明,吡虫啉在鲜茶叶的半衰期分别是1.9～2.2 d。赵文晋等[4]采用高效液相色谱分析方法检测了贵州开阳，黄平和桐梓3地吡虫啉的残留动态。结果表明,在稻田土壤中半衰期为2.79～3.03 d，在水稻植株中降解迅速，半衰期为1.73～2.14 d。仝东超等[5]通过田间试验结果表明，按照1.5倍推荐剂量在小麦苗期手动喷施600 g/L吡虫啉悬浮剂一次，吡虫啉在土壤中残留消解半衰期为6.6～10.0 d。Chauzat等[6]报道法国向日葵花粉的吡虫啉平均为2～3 ng/g，是慢性中毒剂量的20～30倍，蜜蜂采集的花粉样品中有69%样品含有吡虫啉及其代谢物。Godfray等[1]研究发现，花粉中的残留量跨度很广，在1.0～912 μg/kg。在南瓜花粉中吡虫啉残留是122 μg/kg，花蜜中是17.6 μg/kg。王成菊等[7]测定了1.7%阿维菌素/吡虫啉微乳剂对蜜蜂的急性经口和接触毒性，经口测得的LC50为1.790 mg/L，点滴法测得的LC50为0.039 mg/L。史晓斌等[8]试验证实,吡虫啉对蜜蜂也有很大伤害，亚致死剂量和慢性中毒就会影响蜜蜂的生理和行为。【本研究切入点】2013年，欧盟限制吡虫啉、噻虫胺、噻虫嗪3种烟碱类杀虫剂在禾谷类作物和蜜源作物上的使用[2]。2015年中国农业部在全国范围内启动实施了化肥农药使用量“零增长”行动。研究吡虫啉在新疆棉花种植区的残留与消解动态，评估其对传粉昆虫蜜蜂的安全性。【拟解决的关键问题】测定吡虫啉在新疆棉田的残留消解动态及对意大利蜂(Apismellifera)的急性接触毒性，为吡虫啉在新疆棉区使用时对传粉昆虫意大利蜂的安全风险提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材 料

1.1.1 供试生物

试验蜜蜂蜂种为意大利蜂成年工蜂，试验生物由沈阳市化工研究院于洪区王兵养殖场提供。意大利蜂于试验前1 d收集，饲养于蜂笼内，饲喂50%蔗糖水，放置在试验环境中保持24 h适应期，适应期结束后剔除死亡或表现异常的个体，选择大小一致健康的成年工蜂作为试验测试的标准蜂。

1.1.2 仪器与试剂

超高效液相色谱串联质谱系统UPLC-MS/MS(Waters Acquity I-Class系列超高效液相色谱系统、Waters Xevo TQ-S质谱)。

95%吡虫啉(imidacloprid)原药(深圳诺普信农化股份有限公司)；70%吡虫啉水分散粒剂(深圳诺普信农化股份有限公司)；乙腈(质谱纯，赛默飞世尔科技有限公司)，氯化钠(分析纯，天津北联精细化学品开发有限公司)，无水硫酸镁(分析纯，天津北联精细化学品开发有限公司)，C18粉末(北京青云有限公司)。

1.2 方 法

1.2.1 前处理方法

提取采用改进的 QuEChERS 方法。棉花样品，在均质机中粉碎、匀浆，称取10.00 g已经匀浆的棉花叶片、花朵或土壤样品至50 mL离心管，加入乙腈10.00 mL，涡旋30 s，超声5 min，再加入无水硫酸镁4.00 g和NaCl 1.00 g，涡旋提取30 s，在4 500 r/min速率下离心5 min。取上清液2 mL于净化离心管(C18 50 mg、无水硫酸镁150 mg)，然后涡旋30 s，在10 000 r/min速率下离心5 min，取上清液过0.22 μm滤膜，待UPLC-MS测定。

1.2.2 色谱条件

色谱柱为Acquity UPLC BEH C18column (Waters：(2.1×50) mm、1.7 μm)。在电喷雾离子化源(ESI)，多重反应模式(MRM)进行分析。流动相为水-甲酸(99.9∶0.1)和乙腈，梯度洗脱程序如下：0～3 min 水-甲酸∶乙腈=9∶1，3～7 min 水-甲酸∶乙腈=6∶4，7 min后水-甲酸∶乙腈=9∶1。流动相的流速为0.3 mL/min。正模式下质谱条件：脱溶剂气温度和流速为500℃和800 L/Hr；毛细管电压为3.5 kV。列出监测离子参数。表1

表 1 多重反应监测条件(MRM)Table 1 The multiple response monitoring (MRM) condition for analytes detection

1.2.3 田间试验

棉花和土壤的施药和采样方法参照 NY/T 788-2004《农药残留试验准则》进行[9]。于2019年在昌吉华兴农场进行田间试验。设置空白对照区、消解动态处理区，每个小区100 m2，每个处理3次重复，小区及处理间设置保护行。70%吡虫啉水分散粒剂对水后，于棉花开花期时以75 g a.i./hm2均匀喷洒在棉花上部，施药1次。于施药后0、1、3、6、12 h和1、3、5、7 d采样。每个小区随机3点采集棉花叶片、花样品各20 g以及土壤样品40 g。装入自封袋，粘好标签，立即放于-20℃冰箱中保存，待测。

1.3 吡虫啉对意大利蜜蜂急性接触毒性

按照《化学农药环境安全评价试验准则(报批稿)第10部分：蜜蜂急性毒性试验》[10]的要求进行试验，通过预试验确定最高存活浓度和最低致死浓度。在预试验浓度的基础上，以一定的级差(级差小于2.2)设定4～6个浓度，用丙酮将药剂配制成系列浓度，将度过适应期的意大利蜂用二氧化碳麻醉约4 min，迅速用微量点滴器将药液点滴在意大利蜂的中胸背板处，点滴量为2.0 μL/蜂，蜂身晾干后转入试验蜂笼内，用50%蔗糖水饲喂。每个处理3个重复，每个重复10只蜜蜂，并设置对照组。观察24和48 h试验用蜜蜂有无中毒症状及死亡现象，记录死亡数，对试验数据进行统计，计算24和48 h LD50值及95%置信限。

2 结果与分析

2.1 线性范围及检出限

准确称取吡虫啉标准品，用乙腈配制成1 000 mg/L母液，再用乙腈逐级稀释为0.01、0.05、0.1、0.5、1.0 mg/L系列标准溶液。按照上述条件测定，以峰面积为纵坐标，质量浓度为横坐标绘制标准曲线，分别进行线性回归。在0.01～1.0 mg/L质量浓度范围内，吡虫啉的峰面积(y)与浓度(x)呈线性关系，回归方程为y=4 010.25x+2 746.69，相关系数r为0.998 7，最低检测浓度为0.02 mg/kg。表 2

2.2 准确度及精密度

采用标准添加法，在棉花叶片和土壤空白样品中，添加0.02、0.10 mg/kg 2个质量分数水平的吡虫啉标准溶液，每个水平重复5次，测定添加回收率。在棉花叶片和土壤样品的添加回收率介于94.27%～101.63%，相对偏差率介于2.01%～3.85%，符合农药残留试验准则中对残留检测方法的要求，吡虫啉峰型及响应值均较好，能够确保结果判断的准确性 。表3，图1

表 3 吡虫啉在棉花叶片和土壤中的添加回收率Table 3 Recoveries of Imidacloprid in cotton leaf and soil samples at different levels

2.3 吡虫啉在棉花叶片、花及土壤中的消解动态

研究表明，吡虫啉在棉花叶中的消解速率相对于土壤中较快，其在棉花叶片中的消解半衰期4.02 d，在棉花花中的消解半衰期4.30 d，在土壤中的消解半衰期为5.27 d。消解过程均呈负指数函数变化，相关系数均R>0.7，符合一级反应动力学方程，吡虫啉在棉花及土壤中的半衰期<30 d，属于易降解农药。表4

图 1 吡虫啉的TIC图
Fig.1 TIC spectrogram of Imidacloprid表4 吡虫啉在棉花植株及土壤中的消解动态
Table 4 Degradation dynamics of Imidacloprid in cotton plants and soil

间隔期Interval残留量Residualquantity(mg/kg)叶片花土壤0h0.7420.2960.3181h0.6550.2870.2983h0.6460.3440.2616h0.5220.5270.21512h0.2740.4190.3281d0.4060.1880.2423d0.2110.0420.0785d0.0460.0240.1777d

2.4 吡虫啉对意大利蜜蜂急性接触毒性

研究表明，意大利蜜蜂的死亡率与吡虫啉呈现出明显的线性关系。吡虫啉对意大利蜜蜂急性经口毒性试验的24 h LD50为0.072 7 μg a.i./bee；48 h LD50为0.064 9 μg a.i./bee。吡虫啉毒性等级为高毒 。表5，表6

表6 农药对蜜蜂毒性等级划分Table 6 Classification of pesticide toxicity to bees

3 讨 论

吡虫啉是烟碱类杀虫剂的代表品种，具有良好的内吸性，施用后会迅速被植物的根、茎、叶吸收并分布到整个植株，包括花和花粉。害虫取食含有吡虫啉的植物汁液而中毒死亡，非靶标昆虫也可以通过直接接触和间接取食害虫的方式接触吡虫啉。已有研究表明，在植物花粉中烟碱类杀虫剂的检出率极高，这与全球的蜜蜂消失症候群有一定的相关性。Brandt[11]等发现87%的玉米花粉样品能够检出吡虫啉，检出量大部分在10 μg/kg以下。Godfray等[2]研究发现,吡虫啉在花粉中的检出率和残留量都高于花蜜，若在植物拌种时使用吡虫啉，则花粉中残留量在1～51 ng/g；花蜜中为 1～8.6 ng/g；若用吡虫啉处理土壤时，花粉中吡虫啉含量约为9～66 ng/g，花蜜中吡虫啉含量约为1～23 ng/g。吡虫啉田间使用量约为100 mg/L，而吡虫啉对蜜蜂的胃毒毒性为66.7 mg/L，说明蜜蜂在接触到田间正常使用的吡虫啉浓度时就会面临死亡威胁。烟碱类杀虫剂的使用会大大降低采集蜂的归巢能力[12]，影响蜂群的卫生行为[13]。Prisco等[14]的研究中发现噻虫胺可以使蜜蜂体内残翅病毒(DWV)的爆发。

2013年12月，欧盟限制吡虫啉，噻虫胺，噻虫嗪3种烟碱类杀虫剂在禾谷类作物和蜜源作物上的使用[2]。而巴西、加拿大、美国等国家正在对3种新烟碱类杀虫剂进行常规性再登记评价，以期降低或避免其对蜜蜂种群的危害[15]。2018年9月1日，法国政府宣布禁止吡虫啉、噻虫胺、噻虫嗪3种烟碱类杀虫剂的使用。试验测定了吡虫啉在昌吉地区的残留量及对蜜蜂的急性接触毒性，从试验结果可以看出，吡虫啉对意大利蜜蜂的高毒。因此，应高度关注其他传统烟碱类杀虫剂在新疆棉田使用时对传粉昆虫及其他天敌的安全性。

4 结 论

建立了吡虫啉在棉花植株和土壤中的UPLC-MS残留分析方法，前处理采用高效快速的QuEChERS方法，该方法重现性好，操作简单，最低检测浓度LOQ为0.02 mg/kg，满足我国农药残留分析试验准则的要求。虽然吡虫啉在棉花叶片、花和土壤中的消解半衰期均小于7 d，但根据吡虫啉对意大利蜂急性接触毒性的实验结果，吡虫啉的毒性等级为高毒。在新疆棉区使用吡虫啉或其他传统烟碱类杀虫剂时，应加强关注该类杀虫剂对传粉昆虫及其他天敌的安全性，提倡使用对传粉昆虫低毒的新一代烟碱类杀虫剂作为替代产品在新疆棉区推广使用。