石斑鱼头酶解产物的制备及其功能性质

范秀萍，徐 杰，林泽安，汤宴熙，李子青，江彩珍，苏伟明

石斑鱼头酶解产物的制备及其功能性质

范秀萍1,2，徐 杰1，林泽安1，汤宴熙1，李子青1，江彩珍1，苏伟明1

（1. 广东海洋大学食品科技学院// 广东省水产品加工与安全重点实验室// 广东省海洋食品工程技术研究中心// 水产品深加工广东普通高等学校重点实验室，广东 湛江 524088；2. 南方海洋科学与工程广东省实验室，广东 湛江 524088）

【目的】为了提高石斑鱼加工副产物的生物价值，对石斑鱼头中抗氧化活性物质进行分离与功能性质分析。【方法】以珍珠龙胆石斑鱼头为原料，采用生物酶解法，以水解度和DPPH自由基清除率为指标，通过单因素试验和响应面法优化酶解工艺；酶解产物经不同分子质量的超滤膜进行分离，对分离各级分的体外抗氧化活性与功能性质进行研究。【结果】石斑鱼头酶解产物的最佳制备条件是：风味蛋白酶添加量3 000 U/g，在pH 7.0，酶解温度为45 ℃、底物质量浓度300 mg/mL下酶解4.5 h，得到的石斑鱼头粗酶解产物的水解度为（20.27 ± 1.28）%。分子质量< 3 ku的酶解产物（EHH-1）蛋白质质量分数为（13.18 ± 1.17）%，抗氧化活性最显著，其对DPPH自由基、羟自由基、超氧阴离子自由基清除作用的IC50值分别为0.35、4.60、0.46 mg/mL；在pH4.0~ 8.0之间均具有较好溶解性，氮溶指数达到（75.08~ 87.50）%，热稳定性达到（70.00~ 82.00）%，乳化活性为（23.52~ 37.45）m2/g。【结论】石斑鱼头酶解产物分子质量<3 ku的超滤级分具有较强的抗氧化性与良好的功能性质，在天然抗氧化剂和食品加工领域有潜在的利用价值。

石斑鱼头；酶解；自由基清除；功能性质

石斑鱼()，属鲈形目鮨科，主要生长于温海水带区域。目前在石斑鱼的养殖繁育、疾病的预防治疗及遗传育种等方面取得了一定的成果[1-2]。石斑鱼口感滑嫩、营养丰富、肉质鲜美，具有经济价值高、环境适应力强、易饲养、生长速度快等特点[3]，已成为我国海水养殖的主要品种。

目前石斑鱼主要以食用鲜活产品为主要消费方式，其保活、保鲜技术是目前研究的主要方向[3-4]。另外，随着养殖产量的增加，石斑鱼的加工及其加工副产物的开发应用也逐渐引起人们的关注[5]。鱼头是加工过程主要的副产物，石斑鱼的鱼头占全鱼质量比约为10%[6]。笔者以石斑鱼头为研究对象，采用生物酶解技术探讨鱼头中的活性成分物质，并对其功能性质进行分析，以期为石斑鱼的高值化利用提供理论参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

珍珠龙胆石斑鱼（），购于广东湛江霞山水产品批发市场。取鱼头清洗后，经高速组织捣碎机捣碎混匀后，用保鲜袋分装于-20 ℃冷冻备用。

风味蛋白酶（酶活力为18×104U/g）、动物蛋白酶（酶活力23×104U/g）、中性蛋白酶（酶活力20×104U/g）、碱性蛋白酶（酶活力15×104U/g）、木瓜蛋白酶（酶活力为21×104U/g）均购自广西南宁东恒华道生物科技有限责任公司；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）购自上海源叶生物科技有限公司；其他试剂，均为国产分析纯。

1.2 仪器与设备

DS-1型高速组织捣碎机，上海标本模型厂；HHS型电热恒温水浴锅，上海博迅实业有限公司医疗设备厂；pHS-3C型pH计，上海仪电科学仪器股份有限公司；BSA224S-CW型万分之一电子天平，赛多利斯科学仪器（北京）有限公司；Mini pellicon型超滤装置，默克密理博试验室设备(上海)有限公司；5810R型台式高速大容量冷冻离心机，德国艾本德股份公司；GZX-9240MBE型电热鼓风干燥机，上海博迅实业有限公司医疗设备厂；Varioskan Flash酶标仪，美国赛默飞世尔科技公司；FD-551冷冻干燥机，上海爱朗仪器有限公司；Vapodest凯氏定氮仪，德国Gerhardt；SZF-06A型脂肪测定仪，上海洪纪仪器设备有限公司；HX204型卤素水分测定仪，梅特勒-托利多；N-1100V-WB型旋转蒸发仪，上海爱朗仪器有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 鱼头酶解工艺流程 依次为珍珠龙胆石斑鱼头捣碎混匀，按料水比加入蒸馏水，调pH，酶解，100 ℃灭酶10 min，冷却，4 000 r/min离心10 min，取上清液，测定水解度和自由基清除率。

1.3.2 一般营养成分的测定 水分：卤素水分测定仪测定(GB 5009.5-2016)；粗脂肪：索氏抽提法（GB 5009.6-2016）；粗蛋白：凯氏定氮法（GB 5009.5-2016）。

1.3.3 酶解条件的筛选

1.3.3.1 蛋白酶的选取 取鱼头20 g，分别加入

4 000 U/g的风味蛋白酶、碱性蛋白酶、木瓜蛋白酶、中性蛋白酶、动物蛋白酶，在最适pH 7.0（碱性蛋白酶pH为8.0）及温度为50 ℃，底物质量浓度250 mg/mL（鱼头与水的质量体积比），酶解4 h，测得水解度（DH）及DPPH自由基清除率，选取合适的酶。

1.3.3.2 单因素试验

（1）酶添加量对水解度和DPPH自由基清除率的影响：选取风味蛋白酶，在pH 7.0、50 ℃、底物质量浓度250 mg/mL条件下酶解4 h，设置不同酶添加量（1 000、2 000、3 000、4 000、8 000 U/g），分别测得水解度及DPPH自由基清除率，考察酶添加量的影响。

（2）底物质量浓度对水解度和DPPH自由基清除率的影响：选取风味蛋白酶，酶添加量3 000 U/g，在pH 7.0、50 ℃条件下酶解4 h，设置不同底物质量浓度（100、125、250、500、1 000 mg/mL)，分别测得水解度及DPPH自由基清除率，考察底物质量浓度的影响。

（3）pH对水解度和DPPH自由基清除率的影响：选取风味蛋白酶，酶添加量3 000 U/g，在50 ℃、底物质量浓度250 mg/mL条件下酶解4 h，设置不同pH（6.0、6.5、7.0、7.5、8.0），分别测得水解度及DPPH自由基清除率，考察pH的影响。

（4）酶解时间对水解度和DPPH自由基清除率的影响：选取风味蛋白酶，酶添加量3 000 U/g，在pH 7.0、50 ℃、底物质量浓度250 mg/mL条件下酶解，设置不同酶解时间（2、3、4、6、8 h），分别测得水解度及DPPH自由基清除率，考察酶解时间的影响。

（5）酶解温度对水解度和DPPH自由基清除率的影响：选取风味蛋白酶，酶添加量3 000 U/g，在pH 7.0、底物质量浓度250 mg/mL条件下酶解4 h，设置不同温度（40、45、50、55、60 ℃），分别测得水解度及DPPH自由基清除率，考察酶解温度的影响。

1.3.3.3 Box-Benhnken中心组合试验设计 在单因素试验的基础上，固定酶解pH 7.0，每个因素选取3个对水解度影响较大的水平，建立四因素三水平的Box-Benhnken中心组合试验[6]，分别以水解度和DPPH自由基清除率为响应值，各因素的三个水平采用-1、0、1进行编码，如表1。

表1 Box-Benhnken试验因素水平设计

1.3.4 水解度的测定 原料总氮含量用凯式定氮法（GB 5009.5-2016）测定；酸度计法（GB 5009.235-2016）测定样品中的氨基态氮含量。计算公式如下：

水解度（%）=（水解液中的氨基态氮－原料中游离的氨基态氮）/（原料中的总氮－原料中的非蛋白氮）。

1.3.5 酶解产物的超滤分离与抗氧化活性评价 分别以8 ku、5 ku、3 ku的超滤膜对石斑鱼头酶解产物（Einephelus head hydrolysate, EHH）进行超滤分离，浓缩后冷冻干燥分别得到分子质量>8 ku（EHH-4）、5 ~ 8 ku（EHH-3）、3 ~ 5 ku（EHH-2）和< 3 ku（EHH-1）级分。

采用DPPH自由基法[7]、FeSO4-水杨酸法[8]、邻苯三酚自氧化法[9]对石斑鱼头酶解产物与超滤级级分的体外抗氧化活性进行评价。

1.3.6 石斑鱼头酶解产物功能性质的研究 参考文献[10-12]，分别以氮溶指数（%）、热稳定性（%）和乳化活性（m2/g）为指标对石斑鱼头酶解产物与超滤级分的溶解性、热稳定性及乳化性进行分析。双缩脲法测定上清液蛋白质含量。

1.3.7 数据处理 采用MS Excel 2010软件作图，Design-Expert 8.0.5b软件进行响应面优化分析；采用IC50计算软件计算IC50值。

2 结果与分析

2.1 一般营养成分

石斑鱼头的一般营养成分：以湿基计，原材料中的粗蛋白质量分数为（15.13 ± 0.28）%，粗脂肪质量分数为（3.45 ± 0.05）%。与苏红等[13]报道相比，石斑鱼头粗蛋白的含量高于鳙鱼和三文鱼头，略低于金枪鱼头，而粗脂肪含量均低于上述三种鱼头。石斑鱼头可作为一种高蛋白含量加工副产物进行利用。

2.2 酶解工艺优化

2.2.1 蛋白酶的筛选 从图1可以看出，风味蛋白酶的水解度最高，达到15.8%。除了动物蛋白酶，其余4种蛋白酶酪解产物的DPPH自由基清除率达到80%以上，综合考虑，选择风味蛋白酶为本试验酶解用酶。王雪芹等[14]发现风味蛋白酶对鮐鱼也有较好的酶解作用，说明风味蛋白酶是一种良好的水产鱼类水解作用酶。

图1 不同蛋白酶对水解度和DPPH自由基清除率的影响

2.2.2 单因素试验

2.2.2.1 酶添加量的影响 从图2可见，随着酶添加量的增加，水解度不断上升，当酶加量为3000 U/g时，水解度达到最大值，此时鱼头蛋白基本与酶结合饱和，即使酶添加量增加，其水解度也趋于平缓。随着水解度的上升，DPPH自由基清除率呈现波动趋势，但在3 000 U/g酶添加量时水解度达到16.1%，与4 000 U/g酶添加量时水解度（15.8%）差异不明显，且DPPH自由基清除率达到90.2%。因此，选择酶添加量为3 000 U/g进行后续试验。

图2 酶添加量对石斑鱼头水解度与DPPH自由基清除率的影响

2.2.2.2 底物质量浓度的影响 从图3可见，当底物质量浓度逐渐增大时，水解效果缓慢上升，但当底物质量浓度大于250 mg/mL时，水解效果下降，这是因为当底物质量浓度达到一定程度时，已无蛋白酶再与底物结合生成中间产物，酶促反应达到极限。综合考虑，选择底物质量浓度为250 mg/mL。

图3 底物质量浓度对石斑鱼头水解度与DPPH自由基清除率的影响

2.2.2.3 pH值的影响 从图4可见，当pH值从6.0增大至7.0时，pH值对石斑鱼头的酶解效果逐渐递增，在pH 7.0~ 8.0范围内，pH值对石斑鱼头的酶解效果逐渐降低。由于风味蛋白酶是一种中性高活性蛋白酶，当pH值为7.0时，pH对石斑鱼头的酶解效果达到最大。因此，选择pH值为7.0。

图4 pH值对石斑鱼头水解度与DPPH自由基清除率的影响

2.2.2.4 酶解时间的影响 从图5可见，随着酶解时间增加，酶解时间对石斑鱼头水解效果的影响在提升；当酶解时长超过4 h，酶解时间对石斑鱼头水解效果的影响呈下降趋势。洪鹏志等[15]发现，当酶解时间超过4 h之后，酶解效果趋于平缓。本试验结果与之一致，故选择酶解时间为4 h。

图5 酶解时间对石斑鱼头水解度与DPPH自由基清除率的影响

2.2.2.5 酶解温度的影响 从图6可见，最佳酶解温度为50 ℃。随着温度的升高，温度对石斑鱼头的酶解效果明显上升，当酶解温度超过50 ℃时，由于蛋白酶逐渐失活，反应速度变慢，温度对石斑鱼头的酶解效果降低。因此，选择温度为50 ℃。

2.2.3 BBD试验结果与数据分析

2.2.3.1 BBD试验设计方案及结果 根据单因素试验结果，利用Design-Expert 8.0.5b软件设计出试验方案及试验结果，如表2所示。以水解度和DPPH自由基清除率为响应值，以风味蛋白酶酶添加量1、酶解温度2、底物质量浓度3、酶解时间4为自变量，建立四因素三水平中心组合试验设计，共包括29组试验方案，其中24组析因试验点，5组中心试验点，用以计算试验误差。

图6 酶解温度对石斑鱼头水解度与DPPH自由基清除率的影响

表2 Box-Benhnken试验设计与结果

表2续（Continued）

2.2.3.2 回归方程拟合及方差分析 通过Design-

Expert 8.0.5b软件分析，回归分析结果见表3。以水解度为指标，对各因素回归拟合后，得出回归方程：

= 11.85－0.321－1.892+ 1.413－3.604+ 0.5412－0.4613－0.7314－2.1623－1.8624+ 0.5834－3.5712－2.3122－1.1532－0.8242+ 2.08122－1.75123－4.33124+ 1.49122－0.39132+ 0.75232－0.96224+ 1.38232。

由表3可知，该模型的2= 0.990 4，模型整体达极显著水平（< 0.001），失拟项不显著（= 0.193 3>0.05），说明该模型与实际拟合较好，试验方法可靠，自变量与响应值之间线性关系显著，所得方程与实际拟合中非正常误差占比小，所以可用该模型来分析与预测珍珠龙胆石斑鱼头抗氧化活性肽的酶法制备工艺效果。同时，矫正决定系数2adj= 0.955 0 > 0.8，变异系数CV= 7.71%，进一步说明模型拟合程度较好，模型能较好地反映真实的试验值。由各因素的均方值可知，各因素对水解度的影响顺序为：酶解时间>酶解温度>底物质量浓度>酶添加量。酶解时间、酶解温度和底物质量浓度的一次项和二次项对水解度均有显著影响（< 0.05)。

表3 以水解度为响应值的回归模型方差分析

表3续（Continued）

以DPPH自由基清除率为响应值进行回归分析（表4），模型整体不显著（= 0.136 5 > 0.05），失拟项不显著（>0.05），因此选取以水解度为值的模型用于试验。

表4 以DPPH自由基清除率为响应值的回归模型方差分析

2.2.3.3 响应面的交互作用分析 根据Design-Expert 8.0.5b软件，获得响应值的3D曲面，分析各因素对水解度的影响及各因素间的交互作用，如图7~ 9。响应面图等高线的形状反映交互作用的强弱，圆形表示两因素交互作用不明显，而椭圆则表示交互作用明显[16-17]。如图7、8均可看到，在固定其中一个因素后，另一因素对水解度的影响呈先逐渐增加后逐渐减少的趋势。在达到响应曲面最高点时即为水解度的最佳值。投影对应下的等高线图即为椭圆的中心点，此时对应为酶解的最佳条件。如图9，酶添加量和时间对水解度的交互作用不是很明显，其投影的等高线图为未闭合的弧线，但还是可见其有先增加后减少的趋势，固定酶添加量，可见时间变化的后期趋于平缓，根据效益原则，也可得出最佳交互条件。

图7 两因素的交互作用的响应面

Fig. 7 Response surface plots of variable parameters

2.2.3.4 响应面模型验证 根据Box-Benhnken试验所得数据，利用Design-Expert 8.05b软件分析，可得最佳的工艺条件为：酶添加量2 989 U/g（原料）、酶解温度为45.67 ℃、底物质量浓度297.73 mg/mL、时间4.5 h，在此条件下预测的水解度为17.54%。为方便试验操作，将风味蛋白酶添加量定为3 000 U/g、酶解温度为45 ℃、底物质量浓度300 mg/mL、时间4.5 h。平行3次测得的水解度为（20.27 ± 1.28）%，高于理论值，说明采用响应面法优化石斑鱼头肽酶解工艺参数可行。

2.3 鱼头酶解产物的抗氧化活性

由表5可见，石斑鱼头酶解产物EHH-4（>8 ku）超滤级分中粗蛋白质量分数最高，达22.27%，但EHH有较强的DPPH自由基清除作用，IC50值接近于对照组VC；EHH-1（<3 ku）的超滤级分显示出最好的体外清除羟基和超氧阴离子自由基作用。赵忠强等[9]以秋刀鱼为原料制备蛋白酶解液，发现1~ 3 ku级分具有较强的抗氧化性，与本试验结果一致。

表5 石斑鱼头酶解产物的蛋白质含量与抗氧化活性

2.4 功能性质研究

2.4.1 溶解性和热稳定性 通常，溶解性较高是蛋白质其他功能性质的前提。酶解产物溶解性效果见图8，从图8可见，EHH-1、EHH-2、EHH-3和EHH在各pH条件下溶解性均较佳，其中粗酶解产物溶解性最佳，在pH 4.0~ 8.0时，氮溶指数均达到80%以上。分子质量>8 ku级分（EHH-4）的氮溶指数低于其它级分，分子质量<3 ku（EHH-1）级分的氮溶指数在pH 4.0~ 8.0范围内达75.08%~ 87.50%。蛋白质经酶解后多肽链被切断，小肽含量增加，暴露的极性基团较多，亲水性加大，从而使蛋白质溶解性提高。pH 4.0条件下各酶解产物溶解度普遍低于pH 7.0时各酶解产物溶解度，与石斑鱼头酶解产物等电点在pH4.0左右有关，当pH值为等电点时，蛋白质分子呈中性，与水分子的反应程度最小，蛋白质分子相互聚集，此时溶解性降低。

图8 石斑鱼头酶解产物的溶解性

酶解产物的热稳定性效果见图9，从图中可以看出，EHH-1、EHH-2、EHH-3在各pH条件下热稳定性都在60%以上，说明EHH-1、EHH-2、EHH-3在各pH条件下具有较好的热稳定性，且其他各超滤级分相较于其未加热处理时的溶解性都变化不大，甚至一些级分还有所提高，这是因为蛋白质分子经水解后肽链展开，更易与水分子形成氢键，亲水－疏水平衡得到改善，经热处理后酶解产物仍可保持较高的溶解性[18]。这与李利敏[19]对罗非鱼酶解超滤液进行研究，最终得出5 ku透过液、3 ku透过液和1 ku热稳定性最佳的结果一致。

图9 石斑鱼头酶解产物的热稳定性

2.4.2 乳化性 酶解产物的乳化效果见图10，随着pH值的增大，各酶解产物的乳化性逐渐递增，其中以EHH-1、EHH的增长速度较为显著，可见EHH-1的乳化活性为23.52~ 37.45 m2/g。而EHH-3、EHH-4的乳化性较弱，可能是由于超滤分级之后，小分子肽间的会出现强交互作用，降低蛋白表面黏度[20]，造成EHH-3、EHH-4的乳化性低于EHH，而随着分子量进一步的减小，蛋白溶解度增加，从而乳化性又有所提高[21]，所以EHH-1的乳化性高于EHH-3、EHH-4。

图10 石斑鱼头酶解产物的乳化性

3 结论

珍珠龙胆石斑鱼是一种养殖产量巨大的海水经济鱼类，其加工副产物石斑鱼头中含粗蛋白15.13%，是一种优质的蛋白源。本研究通过单因素试验，响应面优化设计后的工艺条件为：pH=7.0，酶添加量3 000 U/g、温度为45 ℃、底物质量浓度 300 mg/mL、时间4.5 h，得出石斑鱼头粗酶解产物（EHH）的水解度为（20.27 ± 1.28）%。石斑鱼头粗酶解产物（EHH）经过不同分子质量的超滤膜分离后得到的石斑鱼头不同分子质量范围的酶解产物，分子质量<3 ku的酶解产物（EHH-1）蛋白质含量为13.18%±1.17%，对DPPH自由基清除率、超氧阴离子自由基清除率和羟自由基清除率最佳，IC50值对应为0.35、0.46、4.60 mg/mL。石斑鱼头粗酶解产物及分子质量<8 ku的酶解产物的溶解性较好；分子质量<8 ku的酶解产物具有较好热稳定性；石斑鱼头粗酶解产物（EHH）和分子质量<3 ku的酶解产物(EHH-1)都具有良好的乳化性。石斑鱼头分子质量<3 ku的酶解产物（EHH-1）具有较强的抗氧化活性与良好的溶解性、热稳定性和乳化性，在食品加工业与天然抗氧化剂的开发利用中具有潜在应用价值。

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Preparation and Functional Properties of Enzymatic Hydrolysis Products of Grouper Head

FAN Xiu-ping1,2, XU Jie1, LIN Ze-an1, TANG Yan-xi1, LI Zi-qing1, JIANG Cai-zhen1, SU Wei-ming1

（1.,////,,524088,; 2.,524088,）

【Objective】To improve the biological value of the processing by-products of grouper, the antioxidant active substances in the head of grouper were separated and were used to analyzed the functional properties.【Method】The pearl gentian grouper head was used as raw material during the bio-enzymatic processing. Hydrolysis degree and DPPH free radical scavenging rate were used as indexes. The optimum conditions for the enzymatic hydrolysate of the grouper head by single factor test and response surface method. The enzymatic hydrolysis products were graded by ultrafiltration membranes with different molecular weight sizes. The antioxidant activity in vitro and functional properties of enzymatic hydrolysis products were studied. 【Result】The grouper head was hydrolyzed by the flavor protease with the amount of 3000 U/g, at 45 ℃ and pH 7.0, 300 mg/ml substrate concentration, for 4.5 h. The degree of hydrolysis of the crude enzymatic hydrolysate of the grouper head was (20.27 ± 1.28) %. The enzymatic hydrolysates with molecular weight lower than 3 ku(EHH-1) had the (13.18 ± 1.17) % protein content, and higher antioxidative activity, with the IC50values of scavenging effect to DPPH radicals, hydroxyl radicals, and superoxide free radicals were 0.35 mg/mL, 4.60 mg/mL, and 0.46 mg/mL, respectively. Furthermore, under the pH range of 4.0-8.0, EHH-1 showed good functional properties, with the Nitrogen solubility index (NSI) reached (75.08－87.50) %, thermal stability of (70.00－82.00) %, emulsifying activity of (23.52－37.45) m2/g. 【Conclusion】Hyperfiltration fraction of molecular weight <3 ku of grouper head enzymatic hydrolysis product showed strong antioxidant activities and good functional properties, which had potential utilization value in the field of natural antioxidants and food processing.

grouperhead; enzymatic hydrolysis; free radical scavenging; functional properties

TS218

A

1673-9159（2020）04-0090-10

10.3969/j.issn.1673-9159.2020.04.013

2019-12-30

南方海洋科学与工程广东省实验室（湛江）资助项目（ZJW-2019-06）；广东省大学生创新创业训练计划资助项目（S201810566063）

范秀萍(1979－)，女，讲师，主要研究方向为水产品保活流通与加工。E-mail: fanxp08@163.com