金钱鱼基因组微卫星分布特征分析及多态性标记开发

王耀嵘，杨 尉,2，任席林，江东能，邓思平，陈华谱，朱春华，李广丽

金钱鱼基因组微卫星分布特征分析及多态性标记开发

王耀嵘1，杨 尉1,2，任席林1，江东能1，邓思平1，陈华谱1，朱春华1，李广丽1

（1. 广东省名特优鱼类生殖调控与繁育工程技术研究中心 // 广东海洋大学水产学院，广东 湛江 524088；2. 阳江职业技术学院 食品与环境工程系, 广东 阳江 529566）

【目的】研究金钱鱼()全基因组微卫星分布特征，筛选高多态性微卫星（SSR）标记。【方法】利用MISA软件对金钱鱼基因组中微卫星进行筛选并分析分布特征，利用聚丙烯酰胺凝胶电泳和毛细管电泳筛选高多态性位点。【结果与结论】金钱鱼基因组总共挖掘390 967个SSR位点，相对丰度为653个/Mb。二碱基重复类型最多（52.64%），微卫星标记整体偏向A+T碱基组合。筛选出23对多态性标记位点，其中7对的等位基因数为4 ~ 11，期望杂合度为0.431 ~ 0.859，观测杂合度0.417 ~ 0.861，多态性含量为0.389 ~ 0.830。经Bonferroni校正后，5个位点符合哈德温伯格平衡，且位点间不存在连锁不平衡现象。

金钱鱼；基因组survey测序；微卫星；标记开发

微卫星亦称SSR（Simple sequence repeats）、短串联重复序列（STR），是真核生物体以少数几个核苷酸为单位、多次串联重复的DNA序列。微卫星标记稳定、可靠，无组织差异，可快速、准确检测且信息含量较高，已广泛用于遗传图谱构建[1]、遗传多样性与遗传结构分析[2-5]、物种/种质鉴定[6]、系统进化分析[7]和亲缘关系鉴定[8]等方面。SSR标记开发引物设计时需准确的SSR位点保守侧翼序列[9]。许多物种基因组非编码区序列信息匮乏，限制了SSR标记开发。传统的SSR标记开发方法有文库法、富集法、省略筛库法和种间共用引物法等[10]。这些方法操作较繁琐，实验周期长，所开发微卫星标记有效性及多态性偏低[11]。高通量测序技术(Next-generation Sequencing, NGS) 使非模式生物基因组和转录组信息大大增加，批量开发SSR标记成为现实。基于基因组测序结果筛选的SSR标记数量多，稳定性好，重复类型多，已成功用于石爬鮡(spp.)[12]、带鱼 ()[13]、竹䇲鱼（）[14]、松江鲈（）[15]等多种鱼类SSR标记的批量开发。

金钱鱼（）又名金鼓鱼，隶属鲈形目（Perciformes）刺尾鱼亚目（Acanthuroidei）金钱鱼科（Scatophagidae）金钱鱼属（）。其营养价值高，味道鲜美，食性广，抗病抗逆性强，盐度适应范围广，是经济价值较高的名特优养殖种类[16-21]。由于过度捕捞、环境污染、气候变化等，我国金钱鱼自然种群资源逐年减少，因此，加强种质资源开发与保护，保障金钱鱼养殖业可持续发展有重要意义。目前，关于金钱鱼分子标记开发等研究较少，SSR标记资源稀少，有效性和多态性偏低，难以支撑种群遗传学深入研究。笔者通过基因组Survey测序构建的金钱鱼基因组文库寻找金钱鱼基因组中SSR位点，开发类型丰富且多态性高的SSR标记，为金钱鱼群体遗传学研究提供多样化和高分辨率分子标记，对金钱鱼种质资源保护和利用有重要意义。

1 材料与方法

1.1 实验鱼

实验用金钱鱼于2018年10月采自广东省湛江市。经质量浓度为100 mg/L的MS-222麻醉后，取背部肌肉置于体积分数95%乙醇中保存。根据相关指导原则进行动物实验并获得广东海洋大学水产学院动物研究与伦理委员会批准（201903004）。

1.2 金钱鱼基因组

本课题组联合诺禾致源公司完成金钱鱼基因组Survey测序，基因组大小为598.73 Mb，原始数据上传至SRA（Short Read Archive）数据库(http://www. ncbi.nlm.nih.gov/sra/)，登录号PRJNA559409。基因组提取及文库构建参考Huang等[22]的方法。

1.3 金钱鱼基因组微卫星标记分布特征

使用MIcroSAtellite（MISA）软件从scaffolds序列中开发微卫星标记序列。查找要求为单核苷酸（Mono-）、二（Di-）、三（Tri-）、四（Tetr-）、五（Penta-）、六核苷酸（Hexa-nucleotides）重复序列的最小重复次数分别为10、6、5、5、5和5次[23]。分析微卫星序列的种类及所占比例。用primer 3软件批量设计SSR引物，所有引物均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.4 SSR标记的开发

选择10个金钱鱼基因组DNA为模板，对随机选择50对SSR标记进行多态性检验，PCR反应体系为：12.5 μL 2×PCR Mix，0.5 μL 正反引物（10 μmol/L），1 μL DNA 模板（10 ~ 50 ng）和10.5 μL 双蒸水。反应条件：95 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s，52 ~ 62 ℃ 30 s（根据引物对应的TM值），72 ℃ 30 s，共25个循环；72 ℃ 5 min。PCR产物通过琼脂糖凝胶电泳检测样品扩增成功率，聚丙烯凝胶电泳统计多态性。选择出现3条或以上特异性条带位点。在筛选的标记中随机选择7对标记添加荧光接头，在30个基因组样本中扩增，扩增产物送至上海翼禾生物公司经毛细管电泳分型后用于后续分析。

1.5 数据分析

用Micro-Checker V.2.2.3软件检测无效等位基因（Null allele）。用Cervus 3.0.7分别计算每个位点的等位基因数（Number of allels，NA）、观测杂合度（Observed homozygosity，o）、期望则合度（Expected homozygosity，e）、多态信息含量（PIC），用Genepop 4.3软件检验位点间的连锁不平衡及群体的哈德温伯格（Hard-Weinberg，HWE）平衡。所有统计学检验的显著性水平（= 0.05）均用Bonferroni法校正。

2 结果及分析

2.1 金钱鱼各重复类型微卫星总体分布特征

金钱鱼基因组共335 162条scaffold，有93 195条含有SSR位点，其中46 043条含有一个以上SSR位点。金钱鱼基因组共挖掘390 967个SSR位点。不同重复类型中，二碱基重复类型最多，共205 789个，占比最高（52.64%），其次是单碱基（141 065个，36.08%）、三碱基（31 228个，7.99%）、四碱基（10 370个，2.65%）、五碱基（2 089个，0.53%），六碱基重复类型占比较少（426个，0.11%）。

2.2 不同微卫星碱基类型核心序列重复数分布

金钱鱼基因组中不同类型的微卫星标记核心区重复数变化范围从5 ~ 82拷贝不等，主要集中在5 ~ 24拷贝，占全部重复数范围的98.84%。10拷贝的SSR数目最多，其次为6拷贝（图1）。

单碱基SSR核心区重复数为10 ~ 82拷贝，主要集中在10 ~ 21拷贝，占单碱基SSR标记的96.27%，10拷贝的标记数目最多，共51 240个；二碱基微卫星核心区重复数6 ~68拷贝，集中在6 ~ 20拷贝，占二碱基微卫星标记的97.94%，6拷贝的标记数目最多，共46 343个；三碱基微卫星核心区重复数为5 ~ 28，集中在5 ~ 12拷贝，占三碱基微卫星标记的99.17%，5拷贝的标记数目最多，共14 700个；四碱基微卫星核心区重复数为5 ~ 25拷贝，集中在5 ~ 10拷贝，占四碱基微卫星标记的98.24%，5拷贝的标记数目最多，共6 041个；五碱基微卫星核心区重复数为5 ~ 24拷贝，集中在5 ~ 8拷贝，占五碱基微卫星标记的95.02%，5拷贝的标记数目最多，共1 176个；六碱基微卫星核心区重复数为5 ~ 12拷贝，集中在5 ~ 7拷贝，占六碱基微卫星标记的97.65%，5拷贝的标记数目最多，共302个（图2）。

图1 金钱鱼基因组中微卫星重复数分布

A-B, 单碱基重复类型；C, 二碱基重复类型；D, 三碱基重复类型；E, 四碱基重复类型；F, 五碱基重复类型；G, 六碱基重复类型

A-B , Mononucleotide; C, Dinucleotide; D, Trinucleotide; E, Tetranucleotide; F, Pentanucleotide; G, Hexanucleotide

图2 金钱鱼基因组中各类型微卫星重复数分布

Fig. 2 Distribution of different copy numbers of various types of microsatellites ingenome

2.3 金钱鱼重复碱基类型特征

金钱鱼基因组中微卫星标记最多的重复类别是AC/GT，共155 982个，其次是A/T，共125 988个（图3）。

图3 金钱鱼基因组中出现最多的10种SSR重复类别

单碱基重复类型中，A/T类别占绝对优势。A/T碱基微卫星重复数共125 988个，占单碱基总数的89.31%；C/G碱基微卫星重复数共150 77个，占单碱基总数的10.69%；二碱基重复类型中，AC/GT碱基微卫星重复数最多，为155 982个，占二碱基总数目的75.80%，其次是AG/CT（17.86%）和AT/AT（6.27%）；三碱重复类型中，AGG/CCT碱基微卫星重复数最多，为8 104个，占三碱基总数的25.95%，其次是AAT/ATT（22.78%）和AAG/CTT（13.79%）；四碱基重复类型中，AGAT/ATCT碱基微卫星重复数最多，为2 112个，占四碱基总数的20.37%，其次是AAAT/ATTT（13.96%）和ACAG/CTGT（12.66%）；五碱基重复类型中，AGAGG/CCTCT碱基微卫星重复数最多，为317个，占五碱基总数的15.17%，其次是AAAAC/GTTTT（9.67%）和AAGAG/CTCTT（8.90%）；六碱基重复类型中，AATCAG/ATTCTG碱基微卫星重复数最多，为161个，占六碱基总数的37.79%，其次是AACCCT/AGGGTT（8.22%）和AAGAGG/CCTCTT（2.35%）（表1）。

表1 金钱鱼基因组SSR中重复碱基优势类别

2.4 金钱鱼多态性标记的开发

随机选择50个SSR位点利用10份金钱鱼基因组DNA扩增检验发现，41个位点有清晰的扩增产物，其中23个位点扩增产物有多态性，GenBank登录号为MT110197 – MT110219（表2）。

表2 金钱鱼23个多态SSR标记信息

表2续（Continued）

表3可见，7对标记SSR位点在30个金钱鱼样品中共检测到58个等位基因，平均等位基因数为8.28，其中SA-SV-2位点的等位基因数最少（a= 4），SA-SV-1位点的等位基因数最多（a= 11）。期望杂合度为0.431 ~ 0.859，平均0.722；观测杂合度为0.417 ~ 0.861，平均0.662。多态性含量为0.389 ~ 0.830，平均0.679。经Bonferroni校正后，SA-SV-3和SA-SV-5位点仍偏离哈德-温伯格平衡，它们无效等位基因频率（0.298 1、0.072 1）和近交系数（0.498 0、0.156 6）均较高。连锁不平衡检测表明，各位点间不存在连锁不平衡现象。

表3 金钱鱼7个多态SSR位点的遗传学特征

注：*，经Bonferroni校正后显著偏离哈德-温伯格平衡（= 0.05）。

Note:*, Significant departure from Harder-Weinberg equilibrium after Bonferroni correction (= 0.05).

3 讨论

3.1 金钱鱼基因组微卫星分布特征

本研究共检测到390 967个微卫星标记。在金钱鱼6种完整的微卫星类型中，二碱基重复类型最多，占微卫星总数的52.64%，其次是单碱基重复类型，占总数的36.08%，其余4种重复类型占比较低，与红鳍东方鲀()[24]、大菱鲆 ()[25]和日本囊对虾（）[26]相似，而与美丽硬仆骨舌鱼（）[27]及部分鲀类[23]的单碱基重复类型微卫星数占优势的结果不同。

在单碱基重复类型中，A碱基在金钱鱼微卫星碱基组成中占绝对优势。在二碱基重复类型中，AC、AG、AT是二碱基重复类型中含量最高的三个类别，与红鳍东方鲀[24]及人类（）[28]二碱基重复类型中排序一致。在三碱基重复类型中，AGG、AAT、AAG比例较高，其中AGG在三碱基重复类型中出现频率最高，与红鳍东方鲀、菊黄东方鲀（）、双斑东方鲀（）和黑青斑河鲀（）相一致[23]。在脊椎动物中有类似报道[29-30]，但在鱼类中这种分布特征并不常见。AGG是参与生物早期生长和发育转录因子的结合位点[31-32]。因此，AGG的高频率分布可能在金钱鱼早期生长调控、性别决定与分化中发挥重要作用。值得注意的是，在五碱基重复类型中，AGAGG是占比最高的类别。这与红鳍东方鲀基因组微卫星统计分析结果一致，与其他鱼类有较大差异。推测AGAGG类别可能在金钱鱼进化及环境适应中有一定作用，重复类别与多种鲀类相似也预示金钱鱼可能与红鳍东方鲀亲缘关系较近。微卫星标记中的优势碱基表明，金钱鱼基因组微卫星标记偏向A+T碱基组合，这一结果与诸多水生生物相同[33-36]。研究表明，物种基因组中微卫星标记数越多，A和T碱基所占比例越高。对于这一现象，Schlötterer等[39]认为，基因组DNA由于甲基化的发生，胞嘧啶C容易脱氨基转变成胸腺嘧啶T。基因组内GC含量少也是维持DNA热力学稳定性的必要条件之一[40]。

金钱鱼基因组微卫星核心区重复数为5 ~ 82拷贝，主要集中在5 ~ 24拷贝，并且随着重复数的增加，各类别微卫星数目逐渐减少。这种现象普遍存在于多种生物的基因组微卫星中。究其原因，可能一方面由于微卫星长度增加，其稳定性降低；另一方面，微卫星重复数越高，突变率越高[41]。

3.2 金钱鱼基因组微卫星标记的开发

金钱鱼基因组中共获得237 017个（95.01%）短碱基SSR（二碱基和三碱基），12 459个(4.99%) 长碱基SSR（四至六碱基）。Liu等[42]利用金钱鱼转录组文库筛选到5 676个短碱基SSR标记及258个长碱基SSR标记，梁镇邦等[14]利用SLAF-Seq（Specific-Locus Amplified Fragment Sequencing）技术，在竹䇲鱼基因组中共获得39 080个短碱基SSR及4 184个长碱基SSR，向玲通[43]过磁珠富集法从金钱鱼基因组中得到65条微卫星序列。由此可见，通过基因组survey测序筛选的SSR标记数量和类型更加丰富，表明基于高通量测序的基因组survey测序是更为快捷、高效的SSR标记分离方法。

本研究挑选的50个SSR位点中，有41个（82%）位点可扩增出1条以上的特异性条带，有23个（56%）位点可扩增出3条或以上特异性条带，表明金钱鱼SSR标记开发成功率较高，本研究所获取的249 902个二至六碱基重复的SSR标记有较高开发潜力，为金钱鱼高多态性SSR标记的开发提供丰富的遗传物质资源。

3.3 SSR标记的多态性及其遗传学特征

本研究所选取的7个SSR标记位点在30个金钱鱼样品中共检测到58个等位基因，平均等位基因数为8.28，高于Liu等[42]报道的金钱鱼SSR标记平均等位基因数（4.17）。Botstein等[44]认为，多态信息含量高于0.5的标记为高多态性标记；小于0.5但高于0.25的为中度多态性标记；小于0.25的标记为低度多态性标记。本研究选取的7个标记中，仅有SA-SV-2为中度多态性标记，其余6个标记均为高度多态性标记。可见，本研究选取的微卫星标记多态性高，蕴含丰富的遗传信息，可在金钱鱼群体遗传研究中为种质评估及种群遗传多样性水平鉴定提供良好的评价工具。

基因多样性是评价群体遗传变异的最适参数[45]。本研究群体的期望杂合度o为0.431 ~ 0.859，平均0.722；观测杂合度e为0.417 ~ 0.861，平均0.662。分别高于Liu等[42]统计的金钱鱼群体平均o（0.387）、e（0.398）以及DeWoody等[46]统计的32种鱼类微卫星标记的平均o（0.63），表明本研究所选的金钱鱼群体遗传变异较高。经Bonferroni校正后，SA-SV-3和SA-SV-5位点仍偏离哈德-温伯格平衡，显示出杂合子缺失的现象。而这两个位点近交系数(分别为0.498 0和0.156 6) 和无效等位基因频率(分别为0.298 1和0.072 1) 较高，表明群体中存在的近交和无效等位基因是导致这两个位点偏离哈温平衡的主要原因。根据Chapuis等[47]提出的参照无效等位基因频率划分的微卫星标记三类标准，SA-SV-5标记（0.05≤ua＜0.20）属于中频无效等位基因位点，该类型位点可能使受测群体遗传多样性降低，并导致群体间遗传距离和遗传分化指数过高。因此，SA-SV-5位点在后续的金钱鱼群体遗传分析中应谨慎使用。而SA-SV-3标记（ua≥0.2）属于高频无效等位基因的位点，且显著偏离哈德-温伯格平衡，表明此位点不适于金钱鱼后续遗传分析。而其余5个具有高多态性、高杂合度、低频无效等位基因的微卫星位点可作为金钱鱼遗传资源研究的可靠分子标记及优先选用标记。

4 结语

从基因组survey测序的结果来看，金钱鱼基因组微卫星以二碱基重复类型及A+T碱基类别为主，微卫星核心区重复数主要集中于5 ~ 24拷贝，其中10拷贝最多。基于基因组survey测序，共检测到249 902个二至六碱基重读的SSR位点，为金钱鱼高多态性SSR标记的开发提供丰富的遗传物质资源。从50个SSR标记中成功开发出23个金钱鱼多态性位点，7对随机选择的标记中，有5对符合哈温平衡且遗传信息含量高，可为金钱鱼种质资源评估、群体遗传多样性分析及群体遗传结构划分提供有力的评价工具。

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Distribution Patterns of Microsatellites and Development of Polymorphic Markers fromGenome

WANG Yao-rong1, YANG Wei1,2, REN Xi-lin1, JIANG Dong-neng1, DENG Si-ping1, CHEN Hua-pu1, ZHU Chun-hua1, LI Guang-li1

（1.//,524088,; 2.,529566,）

【Objective】To develop highly polymorphic SSR markers and analyze the whole genome microsatellite distribution patterns in.【Methods】The MIcroSAtellite (MISA) identification software was employed in data mining and isolate the microsatellites loci in. Microsatellite polymorphism was explored by capillary electrophoresis and polyacrylamide gel electrophoresis.【Result and Conclusion】A total of 390967 microsatellites loci were identified in the genome of, with a relative abundance of 653 per Mb. Among the 1 to 6 different base repeat types of microsatellites, the number of two base repeats was the highest, and the A+T were the most frequent microsatellite classes. A total of 23 pairs of polymorphic markers were identified from the screening, and capillary electrophoresis was performed on 7 of them. The number of alleles per locus ranged from 4 to 11. The expected and observed heterozygosity ranged from 0.431 to 0.859 and from 0.417 to 0.861, respectively. The polymorphism information content ranged from 0.389 to 0.830. After Bonferroni correction, five loci were consistent with the Hardy-Weinberg equilibrium and showed no linkage disequilibrium.

; genome survey sequencing; microsatellite; SSR mining

Q78；Q959.483

A

1673-9159（2020）04-0007-08

10.3969/j.issn.1673-9159.2020.04.002

2020-02-28

国家重点研发计划“蓝色粮仓科技创新”重点专项（2018YFD0901203）；广东省自然科学基金（2019A1515010958、2019A1515012042）；广东省科技厅科技创新战略专项重点项目（2018B030311050）；广东省普通高校青年创新人才项目（2017GKQNCX092）

王耀嵘（1995―），男，硕士研究生，研究方向为鱼类群体遗传学。yaorongwang217@126.com

李广丽（1967―），女，教授，博士，研究方向为鱼类生理与繁殖。guangligdou@163.com

王耀嵘，杨尉，任席林，等. 金钱鱼基因组微卫星分布特征分析及多态性标记开发[J]. 广东海洋大学学报，2020，40(4): 7-14.

（责任编辑：刘庆颖）