罗非鱼唾液酸黏附素基因克隆及组织表达

牛继敏，牛金中,2,3，黄 瑜,2,3，简纪常,2,3，王 蓓,2,3，鲁义善,2,3

罗非鱼唾液酸黏附素基因克隆及组织表达

牛继敏1，牛金中1,2,3，黄 瑜1,2,3，简纪常1,2,3，王 蓓1,2,3，鲁义善1,2,3

（1. 广东海洋大学水产学院 // 2. 广东省水产经济动物病原生物学及流行病学重点实验室 //3. 广东省水产经济动物病害控制重点实验室，广东 湛江 524088）

【目的】研究尼罗罗非鱼（）唾液酸黏附素（）在健康鱼及感染无乳链球菌（）后的组织表达，探讨其在免疫反应中的作用。【方法】根据NCBI上公布的罗非鱼唾液酸黏附素基因（GenBank登录号LOC102078335，记为）克隆开放阅读框序列，采用实时荧光定量PCR技术检测在健康罗非鱼脾脏、头肾、肠道、皮肤、鳃、脑、肌肉、肝、胸腺、脾、外周血中的分布，以及无乳链球菌（）刺激后的表达。【结果与结论】基因编码区1 617 bp，编码538个氨基酸，理论分子质量59.44 ku，等电点6.57。含有3个IG结构域和1个IGC2，是IG结构域蛋白质超级家族成员。多序列比对发现，与其他物种氨基酸序列同源性介于36.81% ~ 92.94%，且与奈里朴丽鱼（）同源性最高。系统进化分析发现，与慈鲷科鱼的聚为一支。在健康罗非鱼各组织中均有表达，在头肾和外周血中表达量最高，其余组织表达量相对较低。经无乳链球菌刺激后，表达量在10个组织中均呈现显著的时序性。

尼罗罗非鱼；唾液酸黏附素；基因；克隆；表达；无乳链球菌

尼罗罗非鱼（）属热带性鱼类，其肉质细嫩，味道鲜美，具生长与繁殖力强、抗病性和适应能力强等特点，在我国南方地区广泛养殖[1]。然而，随着养殖密度的增加，养殖环境恶化，罗非鱼相关病害也随之增加，如无乳链球菌病、罗湖病毒病，给罗非鱼养殖产业造成巨大的经济损失[2-6]。因此，研究罗非鱼免疫系统及免疫应答有重要意义，有助于其疫苗的研发。

唾液酸黏附素(又称Siglec-1或CD169，属于免疫球蛋白超家族类黏附分子，主要表达于单核巨噬细胞和树突状细胞上，参与单核巨噬细胞介导的促炎症反应及T淋巴细胞的激活[7]。还可作为吞噬性受体结合和清除含唾液酸结构的病原体[8]。哺乳动物唾液酸黏附素分子质量约185 ku，其结构高度保守，胞外区域有17个免疫球蛋白样结构域[9]，用于介导细胞与细胞间黏附。胞内缺乏用于信号传导的免疫受体酪氨酸抑制基序（Immunoreceptor tyrosinebased inhibitory motifs，ITIM）。目前，有关鱼类唾液酸黏附素的研究只是在基因组中预测该基因，而关于唾液酸黏附素与其配体的相互作用机制、胞内信号转导机制以及其他生物功能仍未完全阐明。深入探索唾液酸黏附素的分子结构和生物机制对于进一步了解免疫调节机制、干预免疫调节过程均有重要意义。本研究基于罗非鱼唾液酸黏附素基因（记作）在NCBI上公布预测的全长序列设计引物，克隆与预期一致的开放阅读框（ORF），并通过荧光定量PCR的方法对其组织表达模式，以及细菌刺激后该基因在罗非鱼体内的各个组织表达变化展开研究，以期初步了解唾液酸黏附素在罗非鱼免疫系统中所发挥的作用，为后续蛋白纯化、抗体制备提供技术支持，并为进一步研究免疫球蛋白样凝集素家族在硬骨鱼先天免疫中的重要作用奠定基础。

1 材料和方法

1.1 材料

实验用尼罗罗非鱼约150 g，采自广东海洋大学东海岛基地，在30℃左右条件下暂养7 d后用于实验。大肠杆菌（）DH5 α和无乳链球菌（）ZQ0910菌种由由广东省水产经济动物病原生物学及流行病学重点实验室提供。qPCR 试剂盒（TransStart Green qPCR SuperMix）、RNA提取试剂盒（TransZol Up Plus RNA Kit）、cDNA合成试剂盒（TransScript One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix）购自北京全式金公司。PCR引物由生工生物工程股份有限公司合成，Premix Taq® Version 2.0、载体pMD18-T购自TaKaRa公司（大连），DNA回收纯化试剂盒（ThermoScientific GeneJET）购自Thermo公司。

1.2 方法

1.2.1 罗非鱼总RNA提取和cDNA合成 对无乳链球菌刺激组腹腔注射浓度为1×107cfu/mL的无乳链球菌0.1 mL，对照组腹腔注射0.1 mL的磷酸盐缓冲液（PBS）[10]，各组分别在注射后0、6、12、24、48、72、96 h随机取罗非鱼3尾，取脾脏、头肾、肠道、皮肤、鳃、脑、肌肉、肝、胸腺、脾、外周血等10个组织，放入TransZol中，根据TransZol Up Plus RNA Kit说明书提取罗非鱼各组织RNA。按照北京全式金公司的TransScript One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix说明书将罗非鱼10组织总RNA反转录成cDNA，用于基因克隆和不同组织表达分析。

1.2.2 罗非鱼基因的分子克隆 根据NCBI上公布的的基因序列(LOC102078335)，以1.2.1制备的罗非鱼头肾cDNA为模板，用PrimerPremier 5.0设计引物Sial-1F、Sial-1617R（表1），进行PCR扩增，反应体系（20 μL）：Premix Taq 10 μL，ddH2O 7.5 μLcDNA 模板0.5 μL，Sial -1F、Sial-1617各1 μL。PCR反应条件：94 ℃5 min，94 ℃30 s，60 ℃30 s，72 ℃60s，34个循环；72 ℃ 10min，4 ℃下保存[11]。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳检测合格后对其进行切胶回收，目的条带与pMD 18-T载体连接，连接成功后转化至DH5α感受态细胞中，涂布于Amp+的LB琼脂平板上，倒置在37 ℃恒温培养箱内培养8 ~10 h，挑选单菌落于含Amp+的LB液体培养基中，于37℃、160r/min 条件下培养4 h，用通用引物M13和RV（表1）进行菌落PCR鉴定，将阳性克隆送至生工生物公司测序。

表1 引物

1.2.3 qRT-PCR检测的表达 参考文献[12]方法。首先利用的特异性引物sial-RT595F、sial-RT758R（表1），以β-actin为内参基因，用ABI 7500 Real-Time定量PCR仪检测在各个组织以及不同刺激后的表达。qPCR参照TransStart Top Green qPCR SuperMix试剂盒说明书进行，反应体系：TransStart Top Green qPCR SuperMix 5 μL，10 μmol/L上下游引物各0.5 μL，cDNA 0.5 μL，dH2O 3.5 μL。反应程序：95 ℃ 30 s；95 ℃ 5 s，60 ℃ 10 s，72 ℃ 15 s，40个循环。每个样本设置3个复孔。用2-ΔΔCt法[13]计算相对表达量。用SPSS 20.0软件进行单因素方差分析，数据用平均值±标准差表示。

1.2.4 用软件分析阳性克隆结果 对克隆获得的序列用NCBI (https://blast.ncbi.nlm. nih.gov/Blast.cgi)进行比对分析；利用TMHMM Server 2.0 (http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM) 预测跨膜结构域；用Inter ProScan Sequence search (http://www.ebi.ac.uk/Tools)和SMART (http://smart. embl-heidelberg.de/) 预测蛋白功能结构域；用Clutalx和Genedoc软件进行氨基酸同源序列比对。蛋白质二级、三级结构的预测网址分别为PORTER (http://www.distill. ucd.ie/porter)、SWISSM-MODEL (http://swissmodel.expasy.org/interactive)。使用ExPASy ProtParam tool (http://web.expasy.org/ protparam/）进行On-sialoadhesin氨基酸序列推导和相关理化性质分析。通过MEG7.0软件，用邻接法构建系统进化树。

2 结果

2.1 On-sialoadhesin基因克隆与序列分析

基因PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳检测，获得与预期基因一致的片段，为1 617 bp（图1），编码538个氨基酸残基。

M，DL2000 DNA 分子标准; 1，目的基因

经预测，第395～417位氨基酸存在跨膜结构域（图2）；第1～17位为信号肽区域，其中信号肽剪切位点在第17～18位氨基酸之间；该序列功能位点（图3）有细胞附着序列1个，N-糖基化位点6个，酪蛋白激酶 II 磷酸化位点12个，蛋白激酶C磷酸化位点9个，酪氨酸激酶磷酸化位点3个，N-豆蔻酰化位点9个，C-末端靶向信号序列7个，异戊二烯基结合位点4个；蛋白的分子式为C2632H4095N717O818S18，分子质量59.44 ku，理论等电点6.57，偏酸性，丝氨酸（Ser）13.6%，亮氨酸（Leu）8.4%，缬氨酸（Val）8.4%，苏氨酸（Thr）6.5%，总平均亲水性（GRAVY）为–0.323。半衰期为30 h，不稳定指数为44.24，脂肪指数为80.02，根据Guruprasad方法[14]，为不稳定蛋白。

图2 On-sialoadhesin基因核苷酸序列及推导的氨基酸序列和功能位点

2.2 On-sialoadhesin蛋白二级结构和三级结构预测

图4可见，蛋白二级结构以无规则卷曲为主，其中，α-螺旋53个，占总链的35.33%，无规则卷曲76个，占总链的50.67%，β-转角18个占总链的12%，延伸链3个，占总链的2%。对蛋白进行同源模建，获其三级结构模型，其最佳模型是5lfu.1.A（图5），序列一致性为20.87%；另一模型是3laf.1A，序列一致性为20.18%。

2.3 On-sialoadhesin序列同源比对及进化分析

将克隆的基因序列与金头鲷（）、伯氏朴丽鱼（）、雀鸟（）、三趾箱龟（）、泰国斗鱼（）、扬子鳄（）、奈里朴丽鱼（）、斑马拟丽鱼（）、大黄鱼（）等相应的基因序列进行相似性比对，其中罗非鱼与里朴丽鱼序列相似性高达92.75%，与泰国斗鱼序列相似性为67.85%（表2）。构建的罗非鱼唾液酸黏附素基因系统进化树见图6，结果显示，尼罗罗非鱼与同属慈鲷科的朴丽鱼属和拟丽鱼属鱼的亲缘性最近，其次是泰国斗鱼，而与扬子鳄和三趾箱龟等物种相距最远。罗非鱼与慈鲷科各属鱼的聚为1支，同源性较高。

蓝色是α-螺，红色是β-转角，绿色是延伸链，紫色是无规则卷曲

图5 On-sialoadhesin蛋白蛋白跨膜区三维结构

表 2 序列相似性

2.4 On-sialoadhesin在罗非鱼各组织中的分布

的各组织表达检测结果（图7）显示，在健康罗非鱼的10个组织中均有表达，在头肾和外周血中表达量最高，其余组织表达量较低。

图6 邻接法构建的On-sialoadhesin进化树

L：肝；Hk：头肾；Br：脑；In：肠；Sk：皮肤；M：肌肉；Sp：脾；Th：胸腺；G：鳃；B：外周血；On-sialoadhesin水平在肝脏中设为1

2.5 无乳链球菌攻毒后On-sialoadhesin在罗非鱼组织中的表达

图8可见，无乳链球菌攻毒后，在头肾中，12、24 h时显著升高（＜0.05），96 h时极显著降低（＜0.01）。在脑组织中，攻毒后6 h显著下降（＜0.05），12 h和48 h时显著增加（＜0.01），24 h时恢复至正常水平，而在72、96 h时极显著降低(< 0.01)。在皮肤中，6 h时极显著增加（＜0.01），12、48 h时恢复至正常水平，而在24、72 h时显著下降（＜0.05），96 h时极显著降低(< 0.01)。在鳃组织中，攻毒后6、12 h时显著增加（＜0.05），24 h时恢复正常水平，而在48、72、96 h时显著降低（＜0.05）。在肌肉组织中，攻毒后12 h和48 h时极显著增加（＜0.01）而在24 h时极显著降低（＜0.01）。在脾脏中，攻毒后12、24、48和72 h时显著增加（＜0.05），96 h恢复至正常水平。在肠组织中，攻毒后6、48 h时极显著增加（＜0.01），72 h时显著增加（＜0.05），而在12 h时极显著降低（＜0.05），在24、96 h时恢复至正常水平。在肝脏中，6、24和48 h时显著增加（＜0.05），在72、96 h时显著下降（＜0.05），而在12 h时恢复至正常水平，而在72、96 h时显著降低（＜0.05）。在胸腺中，攻毒后24、48 h时显著增加（＜0.05），其他时间无显著差异。在外周血中，攻毒后24 h时极显著增加（＜0.01），而在6、12、48、72和96 h时均呈现显著降低（＜0.05）。综上，攻毒后在头肾、皮肤、鳃、脾脏、胸腺组织中总体上呈先升后降变化，而在脑、肌肉、肠、肝脏、外周血中变化规律不明显，其在所有组织中的表达量均在不同时间升至最大值。

*，与0 h（对照）比较P < 0.05；**，与0 h（对照）比较P < 0.01；On-sialoadhesin在各个对照中的表达量均设为1

3 讨论

本研究成功克隆基因，获得1 617 bp的ORF序列，编码538个氨基酸残基。在推导的序列中发现3个IG结构域和一个IGC2结构域，这些结构域在其他动物该蛋白中也存在[15-16]。免疫球蛋白（IG）是机体受抗原刺激后，由淋巴细胞特别是浆细胞合成的一类有抗体活性或化学结构与抗体相似的球蛋白[17-19]，主要存在于血液和其他分泌液中，也可作为抗原识别受体存在于B细胞膜上。主要功能是特异性结合抗原、活化补体、结合Fc受体、调理吞噬作用、发挥抗体依赖的细胞介导的细胞毒作用[20-22]。序列相似性和系统进化树分析中与奈里朴丽鱼序列相似性高达92.75%，其他不同物种的同源性差，但其中许多功能位点较为保守，系统进化树分析表明，与慈鲷科鱼的聚为1支，亲缘性关系相对较近（图6）。可见，本研究所得序列是Siglecs家族的一员。

唾液酸黏附素在猪免疫器官攻毒实验显示，在心脏、肝脏、脾脏、肾脏、下颌淋巴结和肠系膜等中7 d达最高值，心脏非免疫组织表达量最低。在人类Siglec-1冠心病患者外周血Siglec-1 (CD169) 的基因表达水平，实验组均显著高于健康对照组，表明不同物种唾液酸黏附素基因在免疫组织上的表达仍有相似性[23-24]。本研究中，在健康尼罗罗非鱼各组织中均有表达，但不同组织间表达量差异较大，其中在头肾和外周血中表达量最高，其次是肠、肝脏、脾脏、皮肤、鳃、肌肉、胸腺，在脑中表达量最低。免疫细胞是鱼类进行免疫应答的结构基础[26]，罗非鱼头肾含有单核细胞、巨噬细胞、淋巴细胞、粒细胞等免疫细胞[25]，是罗非鱼重要免疫器官之一，外周血也含有淋巴细胞、单核细胞等免疫细胞；在罗非鱼免疫器官或组织中的高表达可表明其在罗非鱼免疫方面的有重要功能。无乳链球菌是罗非鱼的重要致病菌，目前，鱼类唾液酸黏附素应无乳链球菌刺激的时序表达研究相对较少。本研究通过腹腔注射无乳链球菌诱导表达，发现其在头肾、皮肤、鳃、脾脏、胸腺组织中总体上呈先升后降变化，而在脑、肌肉、肠、肝脏、外周血中变化规律不明显，在所有组织中表达量均在感染后不同时间升至最大值。由此推测，可能参与了罗非鱼抗菌的感染免疫，在罗非鱼体抵抗无乳链球菌感染过程中发挥了重要作用。该基因在各组织中达到最高表达量的时间上有较大差别。可能与无乳链球菌刺激时免疫系统发挥时间的长短和作用机理有关。具体原因还有待进一步研究。

4 结论

本研究成功克隆基因ORF序列，通过结构域分析、序列比对和系统进化树分析，所得基因是Siglecs家族中的一员。在健康罗非鱼各组织中均有表达，经无乳链球菌攻毒后，在脾脏、肠、头肾、肝脏、脑、皮肤、肌肉、胸腺、外周血和鳃等10个组织中表达量均有显著性变化，推测可能参与罗非鱼抗菌感染免疫。

[1] 王斌. 中国罗非鱼出口贸易国际竞争力研究[D]. 无锡：江南大学, 2011.

[2] 陈贺, 吴灶和, 王蓓, 等. 无乳链球菌灭活疫苗对罗非鱼的免疫效果[J].广东海洋大学学报, 2012, 32(6): 50-56.

[3] 柯剑, 赵飞, 罗理, 等. 广东省罗非鱼主养区无乳链球菌的分离、鉴定与致病性[J]. 广东海洋大学学报, 2010, 30(3): 22-27.

[4] 郑琦, 陈一锦, 黄瑜, 等. 尼罗罗非鱼非特异性细胞毒性细胞(NCC)分离条件的优化[J]. 广东海洋大学学报, 2017, 37(3): 123-126.

[5] 雷燕, 肖洋, 赵振峰, 等. 罗非鱼罗湖病毒RT-PCR检测方法的建立及初步应用[J]. 广东海洋大学学报, 2019, 39(3): 1-5.

[6]吴凤雷, 黄瑜, 黄郁葱, 等. 罗湖病毒实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立[J]. 广东海洋大学学报, 2019, 39(5): 31-37.

[7] CROCKER P R, MUCKLOW S, BOUCKSON V, et al. Sialoadhesin, a macrophage sialic acid binding receptor for haemopoietic cells with 17 immunoglobulin-like domains[J]. The EMBO Journal, 1994, 13(19): 4490-4503.

[8] JONES C, VIRJI M, CROCKER P R. Recognition of sialylated meningococcal lipopolysaccharide by siglecs expressed on myeloid cells leads to enhanced bacterial uptake[J]. Molecular Microbiology, 2003, 49(5): 1213-1225.

[9] CROCKER P R, PAULSON J C, VARKI A. Siglecs and their roles in the immune system[J]. Nature Reviews. Immunology, 2007, 7(4): 255-266.

[10] 黄瑜. 罗非鱼NCC活性调控蛋白及效应因子的鉴定与功能分析[D]. 湛江: 广东海洋大学, 2018.

[11] 樊博琳, 黎源, 汪志文, 等. 尼罗罗非鱼基因克隆及其组织表达分析[J]. 广东海洋大学学报, 2018, 38(6): 6-12.

[12] HUANG Y, ZHENG Q, NIU J Z, et al. NK-lysin from Oreochromis niloticus improves antimicrobial defence against bacterial pathogens[J]. Fish & Shellfish Immunology, 2018, 72: 259-265.

[13] 张驰宇, 徐顺高, 黄新祥. 一种新颖简便的荧光实时RT-PCR相对定量方法的建立[J]. 生物化学与生物物理进展, 2005, 23(9): 883-888.

[14] 郭宇立, 倪逸声. 从一级结构预测蛋白质稳定性——Guruprasad, Reedy和Pandit 方法[J]. 生物化学与生物物理进展, 1993(2): 95-99.

[15]ASANO K, KIKUCHI K, TANAKA M. CD169 macrophages regulate immune responses toward particulate materials in the circulating fluid[J]. The Journal of Biochemistry, 2018, 164(2): 77-85.

[16] DE BAERE M I, VAN GORP H, DELPUTTE P L, et al. Interaction of the European genotype porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV) with sialoadhesin (CD169/Siglec-1) inhibits alveolar macrophage phagocytosis[J]. Veterinary Research, 2012, 43(1): 1-10.

[17] 庞碧剑. 罗非鱼免疫记忆及体外淋巴细胞增殖的研究[D]. 湛江：广东海洋大学, 2012.

[18] 黄艳青, 王桂堂, 孙军, 等. 黄颡鱼血清免疫球蛋白的纯化及分子量的初步测定[J]. 水生生物学报, 2003, 27(6): 654-656.

[19] 冯建军, 关瑞章, 林鹏, 等. 鱼类免疫球蛋白分子生物学研究进展[J]. 集美大学学报(自然科学版), 2010, 15(6): 420-427.

[20] 黄健, 唐晓霞. 缺氧缺血性脑病新生儿免疫功能的变化及其影响因素[J]. 海南医学, 2018, 29(6): 792-793.

[21] 张庆璜. 胭脂鱼血清免疫球蛋白单克隆抗体的制备及应用研究[D]. 重庆：西南大学, 2014.

[22] MATUCCI A, MAGGI E, VULTAGGIO A. Mechanisms of action of Ig preparations: Immunomodulatory and anti-inflammatory effects[J]. Frontiers in Immunology, 2014, 5: 690.

[23] 熊怡淞, 王皓, 吴炜霖, 等. 定量RT-PCR测定冠心病患者外周血Siglec-1(CD169)的基因表达水平[J]. 第二军医大学学报, 2008, 29(11): 1307-1310.

[24] 谢周瑞. 猪Siglec-1基因启动子克隆及其在肺泡巨噬细胞特异性表达的验证[D]. 南京：南京农业大学, 2012.

[25] 卜梓斌, 姜志胜, 马珍妮, 等. 氧化高密度脂蛋白通过MAPKs信号转导途径诱导ECV304细胞表达组织因子[J]. 中国病理生理杂志, 2009, 25(4): 636-641.

[25] 张艳秋, 詹勇, 许梓荣. 鱼类免疫机制及其影响因子[J]. 水产养殖, 2005, 26(3): 1-5.

Cloning and Expression Analysis of Sialoadhesin Gene inNile Tilapia ()

NIU Ji-min1, NIU Jin-zhong1,2,3, HUANG Yu1,2,3, JIAN Ji-chang1,2,3, WANG Bei1,2,3, LU Yi-shan1,2,3

（1.// 2.// 3.,524088,）

【Objective】To study the expression ofgene in healthy and sick tilapia () challenged by, and explore the role ofin the immune response of Nile tilapia. 【Method】The open reading frame ofgene (was cloned according to the sequence published on NCBI (GenBank accession number LOC102078335). Real-time quantitative PCR was used to detect the distribution ofin spleen, head kidney, intestine, skin, gill, brain, muscle, liver, thymus, and blood and its expression afterstimulation. 【Result and Conclusion】The coding region ofgene was 1 617 bp, encoding 538 amino acids, with a theoretical molecular mass of 59.44 ku and an isoelectric point of 6.57.contains three IG domains and an IGC2 domain, belongs to the IG domain protein superfamily. Multiple sequence alignments revealed thatshare high sequence homology withof other species ranging from 36.81% to 92.94% and have the highest homology with. Phylogenetic analysis revealed thatandclustered together. Real-time quantitative PCR analysis showed thatwas expressed in all examined tissues of healthy tilapia, with the highest expression in head kidney and peripheral blood. The expression ofin all tissues showed significant time-dependent manner postinfection.

;; gene; clone; expression;

Q78；Q959.483；S941.42

A

1673-9159（2020）04-0021-08

10.3969/j.issn.1673-9159.2020.04.004

2020-01-30

国家自然科学基金青年基金项目（31702386）；广东省科技厅国际科技合作领域项目（2017A050501037）

牛继敏（1989—），女，硕士研究生，研究方向为水产经济动物病害防治。E-mail:1018829854@qq.com

简纪常（1964—），男，教授，研究方向为水产经济动物病害防治。E-mail: jianjc@ gdou.edu.cn

黄瑜（1986—），男，博士，研究方向为鱼类免疫学。E-mail：huangyu@gdou.edu.cn

牛继敏，牛金中，黄瑜，等. 罗非鱼唾液酸黏附素基因克隆及组织表达[J]. 广东海洋大学学报，2020，40（4）：21-28.

（责任编辑：刘庆颖）