2种炮制方法对女贞子多酚含量及脂肪酸组成的影响

余 静，陈方圆，刘腾飞，谢丹丹，蒋立勤

(浙江中医药大学 药学院，浙江 杭州 310053)

女贞子为木犀科(Oleaceae)植物女贞(LigustrumLucidumAit.)的干燥成熟果实，是我国传统中药，主要分布于浙江、江苏、湖南、陕西、甘肃等地[1]。女贞子始载于《神农本草经》，谓其“味苦平，主补中，安五脏，养精神，出百病”，具有补益肝肾、滋阴清热、凉血明目、乌须发等功效，临床应用已有2 000多年的历史[2]。现代药理研究表明，女贞子具有抗肿瘤、保肝、抗炎、提高机体免疫功能、抑菌、降血脂、抗衰老等作用[3-4]，临床多用于糖尿病、高血脂、高血糖、肝炎等疾病的治疗[5-8]。现代研究表明，女贞子中主要含有三萜类、苯乙酸苷、黄酮类、脂肪酸、挥发油等成分[9]。女贞子在临床使用中多为炮制品，常用的炮制方法有酒制、醋制、盐制等[10]，药品经过炮制后其药性、毒性、化学成分、药理作用都会发生一定的改变[11-14]。目前，对于女贞子的研究主要集中在三萜类、黄酮类成分上[15-16]，对于多酚及脂肪酸组成的研究较少。故本实验对经不同方法炮制的女贞子中的多酚含量及脂肪酸组成进行分析，以期为女贞子的临床应用、科学生产加工提供理论依据。

1 材料与试剂

1.1 试剂

女贞子：2018年5月购于杭州富阳，经浙江中医药大学资源教研室老师鉴定为真品，去除杂质后晒干备用。钨酸钠、钼酸钠、磷酸、盐酸、无水硫酸锂、溴水、无水碳酸钠、焦性没食子酸、无水乙醇、冰乙酸、石油醚、氢氧化钾、氢氧化钠等均为分析纯；正己烷为色谱级。

1.2 仪器与设备

TDL-5-A型低速台式大容量离心机(上海安亭科学仪器厂)；XMTD-204数显恒温水浴锅(上海梅香仪器有限公司)；GZX-9070MBE数显鼓风干燥箱(上海博讯实业有限公司医疗设备厂)；SHZ-D(Ⅲ)循环水式真空泵(巩义市英峪予华仪器厂)；R-201旋转蒸发仪(上海申胜生物技术有限公司)；DLSB-210低温冷却液循环泵(郑州长城科工贸有限公司)；FW135中草药粉碎机(天津市泰斯特仪器有限公司)；KQ-250DE型数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)；YP601N电子天平(上海精密仪器有限公司)；725型可见分光光度计(北京普析通用仪器有限公司)；BCD-216E冰箱(伊莱克斯中国有限公司)；GC-MSQP2010气相色谱-质谱联用仪(日本岛津公司)。

2 实验方法

2.1 女贞子预处理

将女贞子原料除杂晒干，备用。

2.2 女贞子的炮制

称取预处理后的女贞子样品50g，共16份，按《中国药典(2015年版)》标准对女贞子进行酒制和醋制，分别蒸制1 h、2 h、3 h、4 h、5 h、6 h、7 h、8 h后烘干备用。

2.3 多酚测定

2.3.1 样品多酚提取 分别称取粉碎后女贞子生品及炮制品粉末，按照1∶20的料液比加入50%的乙醇溶液20 mL，在120 W功率下，超声提取80 min。取出提取液，在3 000×g条件下离心10 min，取上清液。

2.3.2 标准曲线绘制 称取100 mg焦性没食子酸，用50%乙醇溶液溶解后定容于100 mL容量瓶。用移液管分别移取1.5 mL、3.0 mL、4.5 mL、6.0 mL、7.5 mL的焦性没食子酸标准液于100 mL容量瓶中分别用50%乙醇溶液定容至刻度，摇匀，得浓度分别为15、30、45、60、75 mg/L的标准没食子酸液。用移液管移取一定体积的Folin酚试剂，将其稀释十倍待用。取Folin酚试剂稀释液4 mL加入到1 mL配制后不同浓度的标准没食子酸液中，然后加入5 mL 7.5%的碳酸钠溶液，25 ℃下显色2 h，在765 nm处测定吸光度。

2.3.3 样品中多酚的测定 取“2.3.1”项下的提取液1 mL置于50 mL容量瓶中，用50%的乙醇溶液定容至刻度，摇匀备用。按上述步骤测定并计算经过炮制后女贞子中多酚的含量变化。

2.4 GC-MS分析脂肪酸组成

2.4.1 索氏提取法提取脂肪酸 准确称取女贞子生品、酒制4、8 h和醋制1、4 h样品各10.00 g，置于滤纸筒中，放于索氏提取器上，加入150 mL石油醚，于80 ℃水浴中回流提取8 h。过滤后收集提取液，旋蒸至无石油醚，得油状物质。备用。

2.4.2 脂肪酸甲酯化 称取女贞子生品及酒制4、8 h，醋制1、4 h女贞子油脂各0.100 g至玻璃试管中，加入0.5 mol/L氢氧化钾甲醇溶液4 mL，65±5 ℃加热15 min，再加入4 mL三氟化硼甲醇溶液，在65±5 ℃加热20 min，冷却至室温，加入5 mL正己烷和5 mL饱和氯化钠水溶液振荡数分钟后3 000×g条件下离心10 min分离水相与有机相，在分离的水相中加入3 mL正己烷振荡、分离，弃水相，合并有机相，上述步骤重复3次。再在此有机相中加入蒸馏水洗，合并有机相弃水相，反复3次，最后将合并的有机相用氮气吹干浓缩至1.0 mL备用。

2.4.3 气相色谱条件 色谱柱：1nnnowax(30 m×0.32 mm，0.25 μm)；升温程序：60 ℃保持2 min，以6 ℃/min升至240 ℃，保持10 min；气化温度：250 ℃；分流进样，进样量1 μL；载气(He)流量：1 mL/min。

2.4.4 质谱条件 电子轰击(electron impact，EI)离子源；电子能量70 eV；灯丝发热电流0.25 mA；电子倍增器电压1 000 V；离子源温度：200 ℃；接口温度：250 ℃；质量扫描范围：m/z 40-550。

2.4.5 定性分析 通过化学工作站数据处理系统及标准质谱库进行数据处理和化合物检索，结合人工质谱解析确定脂肪酸组成。

3 结果与分析

3.1 标准曲线

多酚标准曲线如图1所示，没食子酸的浓度在15～75 mg/L之间，R2=0.999 0，相关性良好。

图1 多酚标准曲线

3.2 炮制后女贞子多酚含量变化

图2 女贞子炮制前后多酚含量变化

由图2可知，女贞子在酒制1 h时多酚含量下降，但在2～4 h之间多酚含量逐渐升高，并于4 h时达到最高值，之后多酚含量随着酒制时间的增加而减少，又以6～8 h时下降趋势明显；女贞子在醋制1 h时多酚含量下降显著，之后随着炮制时间的增加呈小幅度上下波动的趋势。将酒制女贞子多酚含量变化与醋制女贞子进行比较，酒制女贞子和醋制女贞子多酚含量在炮制8 h时基本一致。酒制女贞子在炮制4 h时，多酚含量达到最大值；而醋制女贞子在炮制后，多酚较生品有所下降。

3.3 炮制后女贞子中脂肪酸定性分析

1：十六烷酸甲酯;2：十八烷酸甲酯;3：9-十八烯酸甲酯；4：9，12-十八二烯酸甲酯；5：9，12，15-十八碳三烯酸；6：二十碳烷酸甲酯；7：11-二十碳烯酸甲酯

从女贞子生品和酒制4、8 h，醋制1、4 h女贞子中抽提的脂肪经甲酯化后的GC-MS总离子流如图2(A、B、C、D、E)所示，其脂肪酸组成见表1。

表1 女贞子炮制前后脂肪酸组成及其相对含量

由表1可知，女贞子炮制前后，脂肪酸种类仅一种之差，相对含量未发生明显变化。生品中分离鉴定出6种脂肪酸，占总提物含量的99%；酒制4 h、8 h与醋制1 h、4 h炮制品中分别分离鉴定出7种脂肪酸，分别占总提物含量的100%、99.99%、100%、100%。生品、酒制4 h、8 h与醋制1 h、4 h炮制品中，饱和脂肪酸分别占总脂肪酸总含量的14.69%、13.48%、15.73%、15.11%、14.57%，均以棕榈酸、硬脂酸为主；不饱和脂肪酸分别占84.31%、86.52%、84.26%、84.89%、85.43%，其中油酸含量最高，亚油酸次之。生品、酒制4 h、8 h与醋制1 h、4 h炮制品的O/L值分别为1.56、1.72、1.60、1.58、1.71。

4 结论

女贞子在酒制过程中多酚含量的变化规律为先降低，再升高，最后再降低。酒制前1 h内女贞子中多酚含量降低可能是因为女贞子内的多酚类物质氧化且酒制导致多酚类物质溶出的效果还不明显，所以多酚含量先降低。在2～4 h期间，酒制有利于多酚类物质的溶出效果逐渐体现，致使其与多酚类物质的氧化在4 h附近达到一个动态平衡。后溶出的多酚类物质逐渐被分解，导致多酚含量又开始下降。女贞子醋制过程中多酚含量的变化规律是先大幅降低，再随时间变化呈小幅上下波动趋势。虽然醋酸能使苷类物质转化为多酚类物质，但是推测在此酸性条件下，多酚类物质的氧化速率更快，从而使多酚含量在醋制的第一个小时内就呈显著的下降趋势。

将女贞子生品油脂含量与酒制8 h、4 h，醋制1 h、4 h进行比较，所有组中不饱和脂肪酸和单不饱和脂肪酸所占的比例均较高。油酸具有降低胆固醇、预防心脏病的作用[17-18]。女贞子生品油酸含量最低，为49.60%；经过炮制后，油酸的含量均有不同程度的上升；其中酒制8 h女贞子中油酸含量最高，达53.42%，具有较高的营养价值。亚油酸自身无法合成或合成很少，所以必须由外界获取，具有降低血液胆固醇、预防动脉粥样硬化等作用[19-20]。女贞子生品中亚油酸含量为31.87%，略高于另外4组女贞子样品，而醋制4 h女贞子中亚油酸含量最低，为30.62%。这可能是由于亚油酸炮制受热后出现了分解变质的现象。O/L值是衡量含油脂物质及制品稳定性的重要化学指标，比值越大其油脂稳定性越好[21]。酒制4 h女贞子的O/L比值最高，为1.72，醋制4 h女贞子O/L比值次之，为1.71，说明酒制4 h及醋制4 h女贞子的稳定性较好，有利于加工生产和储存。

综上所述，女贞子经过炮制后，其多酚含量与脂肪酸组成均有不同程度的变化，其中酒制4 h是较为适宜的炮制方法。