白藜芦醇对银屑病模型小鼠皮损的影响及机制研究

王延乾，甘 泉

(新乡市中心医院 皮肤科，河南 新乡453000)

银屑病属于一种常见的免疫介导性皮肤病，以皮肤出现鳞屑、红斑为主要特征，以淋巴细胞浸润、角质细胞异常增生、细胞因子分泌异常为主要病理表现[1]。目前对其治疗仍无特效药物，主要是进行对症治疗，以改善患者临床表现为主。治疗银屑病的西药主要包括糖皮质激素、维生素D3类、维A酸、蒽林及免疫抑制剂等，寻求有效药物对银屑病的治疗意义重大。白藜芦醇(resveratrol，RSV)是一种多酚类物质，具有抗肿瘤、免疫调节、抗炎、心血管保护、神经保护及抗衰老等作用[2]。有研究显示[3]，其对多种皮肤病有预防、治疗作用，能通过改善氧化应激指标(ROS、MDA)改善银屑病模型小鼠的症状。不过，是否有其他发挥治疗作用的途径值得深入探讨。本研究旨在探讨白藜芦醇对银屑病样模型小鼠皮损的影响及可能的作用机制，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 实验动物

Balb/c小鼠(雄性)60只，体质量17～20 g，9周龄，从上海西普尔生物公司购买，许可证编号：SCXK(沪2013-0002)。室温下正常喂养。

1.2 仪器与试药

全自动染色机、PCR仪器、光学显微镜等由日本Olympus公司提供；白藜芦醇由碧云天生物研究所提供，质量分数≥98%；甲氨蝶呤片由上海信宜制药公司生产，批号：20171208；咪喹莫特乳膏(5%)由四川明欣制药公司生产，批号：20171112；DAB显色液由北京中杉金桥生物公司提供；CD3+、CD11c+单克隆抗体、CGRP多克隆抗体、增殖细胞核抗原(PCNA)抗体由Abcam提供；NK-1R、SP、NPY单克隆抗体由Immunoway提供；BCA定量试剂盒、PCR试剂盒购自北京博奥森生物公司。

1.3 造模分组及给药

根据冉立伟等[4]的制备方法进行银屑病小鼠造模：麻醉小鼠(给予戊巴比妥钠腹腔注射，剂量80 mg/kg)，背部去毛备皮(面积3 cm×2 cm)，单笼饲养。采用随机数字表法将备皮的小鼠分为对照组、模型对照组、阳性对照组(甲氨蝶呤)、低剂量组(白藜芦醇10 mg/kg)、高剂量组(白藜芦醇20 mg/kg)，各12只。对照组小鼠在备皮处用凡士林适量涂抹，1次/d，其他各组小鼠备皮处给予咪喹莫特乳膏(5%)62.5 mg，1次/d；造模同时，低、高剂量组分别给予白藜芦醇10 mg/kg、20 mg/kg，腹腔注射，1次/d；阳性对照组给予甲氨蝶呤片溶液1 mg/kg灌胃，1次/d。各组均连续用药7 d。

1.4 银屑病模型小鼠疾病严重程度及皮损面积评分(PASI)

用数码相机每日拍照，观察小鼠鳞屑、红斑、浸润情况，每日进行PASI评分(包括鳞屑、红斑、浸润，每项均为0～4分)。

1.5 小鼠皮损处组织形态变化

造模7 d后，取小鼠背部皮肤置于福尔马林中，2 d后脱水，用石蜡包埋，切片，HE染色，光镜下对小鼠皮肤病理情况进行观察。在400倍镜下，将每个标本选切片6张，并在每张中随机测量6处表皮层厚度(表皮角质层至基底层间的垂直厚度)，以观察表皮层的增厚状况。

1.6 小鼠皮损浸润等指标检测

制备石蜡切片(厚度：5 μm)，用免疫组化法(IHC法)对CD3+、PCNA表达进行检测，用免疫荧光法(IF法)对CD11c+树突状细胞(DC)、NK-1R、CGRP表达进行检测。每个标本随机取6个视野，用IPP6.0分析系统对图像进行分析，记录IOD值。

1.7 小鼠皮损组织P物质(SP)、神经肽Y(NPY)蛋白表达检测

采用Westem Blot法进行检测：取小鼠皮损组织进行裂解提取总蛋白，用BCA法进行蛋白定量。对蛋白样品进行电泳，然后湿转至硝酸纤维素膜上面，封闭后在室温条件下轻摇30 min，根据说明书依次加一抗、二抗、洗膜，胶片曝光后显影及定影。用Image J软件读取IOD值。

1.8 统计学方法

采用SPSS20.0统计软件进行分析。计量资料用((x±s)表示，组间比较采用两独立样本t检验，多组比较采用单因素方差分析，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 小鼠皮损红斑、鳞屑及浸润情况及PASI评分

经肉眼观察，对照组小鼠皮肤粉嫩、光滑，无改变；其他各组在2、3天时开始有皮损，红色斑点渐渐扩大到片状，有鳞屑、浸润出现。与模型对照组同期比较，从第3天开始用药组PASI评分明显降低，以阳性对照组及大剂量组降低更明显，P<0.05。见图1、图2。

图1 各组小鼠第7天后皮损情况

注：与模型对照组比较，aP<0.05；与小剂量组比较，bP<0.05

2.2 小鼠表皮组织形态

HE染色结果显示，对照组小鼠皮肤表皮层相对较薄，模型对照组则明显增厚，并出现角化过度、角化不全，基底细胞核有较多分裂象，炎性细胞浸润较重；阳性对照组、低剂量组及高剂量组与模型对照组比较，表皮相对较薄，出现角化不全细胞相对较少，基底细胞核分裂也不明显，浸润也较轻。7天后，模型对照组表皮层厚度明显高于对照组，P<0.05;用药组表皮层厚度均明显低于模型对照组，以阳性对照组、高剂量组改善更明显，P<0.05。见图3、图4。

图3 各组小鼠皮损组织HE染色(×400)

注：与对照组比较，aP<0.05；与模型对照组比较，bP<0.05；与低剂量组比较，cP<0.05

图4 小鼠在7 d后表皮层厚度分析

2.3 各组小鼠7天后皮损组织中CD11c+DC、CD3+及PCNA表达情况

7天后，模型对照组CD11c+DC、CD3+及PCNA表达均明显高于对照组(P<0.05)；用药组CD11c+DC、CD3+及PCNA表达均明显低于模型对照组，以阳性对照组、高剂量组降低更明显(P<0.05)。见表1。

2.4 各组小鼠7天后皮损组织中NK-1R、CGRP表达情况

7天后，模型对照组NK-1R、CGRP表达均明显高于对照组，P<0.05；用药组NK-1R、CGRP表达均明显低于模型对照组，以阳性对照组、高剂量组降低更明显(P<0.05)。见表2和图5、图6。

组别nCD11c+DC(IOD)CD3+(个)PCNA(个)对照组12151.56±30.285.71±0.2926.12±7.89模型对照组122058.24±1135.21a21.71±2.23a92.12±9.87a阳性对照组12426.36±125.67bc11.71±1.49bc68.54±15.47bc低剂量组12524.69±147.62b16.15±1.98b75.51±16.21b高剂量组12422.74±126.24bc10.05±1.68bc66.17±15.38bc

注：与对照组比较，aP<0.05；与模型对照组比较，bP<0.05；与低剂量组比较，cP<0.05。

表2 各组小鼠7d后皮损组织中NK-1R、CGRP表达情况

注：与对照组比较，aP<0.05；与模型对照组比较，bP<0.05；与低剂量组比较，cP<0.05。

注：IF×200;其在真皮层分布，阳性表达呈现绿色荧光

注：IF×200;其分布与血管密切联系，表达于皮下及真皮组织，阳性表达呈现红色荧光

2.5 各组小鼠皮损组织中SP、NPY蛋白表达

与对照组比较，模型组NPY蛋白表面明显升高，P<0.05；与模型对照组比较，用药组NPY蛋白表达明显降低，以阳性对照组、高剂量组降低更明显，P<0.05；与对照组比较，模型对照组及用药组SP表达均明显升高，P<0.05;模型对照组与用药组SP表达比较，差异无统计学意义，P>0.05。见图7、图8。

注：①对照组；②模型对照组；③阳性对照组；④低剂量组；⑤高剂量组

3 讨论

银屑病是一种炎症性、以T淋巴细胞活化异常为主要表现的免疫性疾病[5]。临床上一般用咪喹莫特制造银屑病小鼠模型，甲氨蝶呤则属于一种免疫抑制剂，常作为实验研究的阳性对照用药。银屑病发病机制较复杂，大多研究认为其发病与神经免疫调节相关[6]。有资料显示[7]，T淋巴细胞免疫激活主要以树突状细胞(DC)活化作为先导，也就是说，在银屑病发生的过程中，DC位于上游环节，DC异常活化导致发生“细胞因子风暴”，使IL-1β、IL-6、IL-7、IL-12、IL-23等细胞因子释放增加，从而导致银屑病的缠绵与反复。本研究结果显示，使用白藜芦醇治疗的低、高剂量组小鼠在用药后PASI评分、皮损处表皮层厚度均明显降低，且以大剂量组改善更明显，由此提示，白藜芦醇对银屑病有一定的治疗作用，且有一定浓度依赖性。

注：与对照组比较，aP<0.05；与模型对照组比较，bP<0.05；与低剂量组比较，cP<0.05

DC除与细胞因子有关外，还可能与多种神经肽有关。在皮肤中，神经肽除了由神经纤维释放外，角质形成细胞、树突状细胞均能够直接释放神经肽。NK-1R能促进DC发生免疫刺激，DC又能促进NK-1R表达，并与神经调节中的适应性免疫及固有的免疫机制关系密切[8]。NK-1R为SP的作用受体，二者结合能够增强DC抗原的提呈作用[9]，维持DC的存活，促进DC释放IL-12等细胞因子。本研究结果显示，白藜芦醇低、高剂量组小鼠皮损组织中NK-1R、CD11c+树突状细胞、CD3+T淋巴细胞表达均明显低于模型对照组，由此推测，白藜芦醇通过DC-NK-1R/SP-细胞因子轴降低角质形成细胞的增殖(本研究显示，用药组小鼠PCNA表达明显降低)及淋巴细胞的浸润，从而发挥治疗作用。

CGRP是一种内源性血管扩张剂，由37个氨基酸所组成，其主要参与炎症细胞的募集，在皮肤的炎症、免疫发展中起着重要的作用。动物及人体中除了外周神经及中枢神经组织中能表达CGRP外，角质形成细胞也存在CGRP表达，CGRP对角质形成细胞的增殖有促进作用。有研究证实[10]，CGRP能加重皮肤瘙痒及炎症的发展，其受体在银屑病组织中均呈现高表达。本实验结果显示，白藜芦醇低、高剂量组小鼠炎症反应较轻，表皮增殖不明显，表皮层相对较薄，这可能与白藜芦醇对CGRP、NK-1R下调有关。

NPY含有36个氨基酸，其可参与皮肤炎症反应，影响相关细胞因子分泌。在免疫/炎症反应中，NPY能够募集DC，从而发挥促炎作用。本实验结果显示，白藜芦醇低、高剂量组小鼠NPY蛋白表达明显比模型对照组低，且以高剂量组NPY蛋白表达降低更明显，由此推测，白藜芦醇可能通过减少NPY表达，进而降低DC在皮损处募集发挥作用。本实验结果还显示，除对照组SP表达相对较低外，其他各组SP表达差异不明显，这提示，白藜芦醇对SP表达作用不明显，但此结果仍需进一步研究来证实。

综上所述，白藜芦醇能明显减轻淋巴细胞浸润，降低表皮细胞异常增殖，改善银屑病模型小鼠皮损的症状。其可能是通过调节NK-1R、CGRP、NPY表达发挥治疗作用。