复方黄黛片含药鼠血清对HL-60细胞的作用研究

侯美辰，张英杰，李 旭，姜 爽，樊 磊，史 丹，王晓波*

(1.辽宁中医药大学 药学院，辽宁 大连 116600；2.中国人民解放军联勤保障部队第九六七医院，辽宁 大连 116021；3.大连医科大学，辽宁 大连 116044)

复方黄黛片是由雄黄为君药、青黛为臣药、丹参和太子参为佐使药组成的复方片剂。在临床上对急性早幼粒细胞白血病有良好的治疗效果，可达到98.6%的完全缓解率。在体外研究实验中，主要以复方黄黛片中的单味药雄黄或联合青黛作用于K562、HL-60细胞的研究，不能很好体现复方黄黛片各组分融合后对白血病细胞的作用。本研究运用血清药理学的方法，采取“半体内”的过程将复方黄黛片制成复方黄黛片含药血清作用于HL-60细胞，以更加准确地阐述复方黄黛片对早幼粒白血病细胞的凋亡作用，为中药复方制剂作用于体外实验提供新途径。

1 实验材料

1.1 实验动物和细胞株的来源

雄性SD大鼠(清洁级)40只，鼠重200～240 g，购自辽宁长生生物技术股份有限公司，生产许可证号：SCXK(辽)2015-0001。人白血病细胞HL-60购自上海中科院细胞库。

1.2 实验主要仪器

Accuri C6流式细胞仪(美国Bio-Rad公司)，Multiskan Mk3酶标仪(美国Thermo公司)，IX71倒置式荧光显微镜(日本Olympus公司)，Amersham Imager 600(美国GE公司)。

1.3 实验主要药品和试剂

复方黄黛片(产品批号：180401，天长亿帆制药有限公司)，CCK-8试剂盒(碧云天生物技术研究所)，Annexin V-FITC/PI细胞凋亡检测试剂盒(美国BD公司)，Calcein-AM/PI活细胞/死细胞双染试剂盒(北京索莱宝科技有限公司)，Hoechst 33258细胞核染液(碧云天生物技术研究所)。

2 实验方法

2.1 含药鼠血清的制备

①配制复方黄黛片混悬液：称5 g羧甲基纤维素钠，再量取1 000 mL dd H2O定容，制成0.5%羧甲基纤维素钠试剂。70片复方黄黛片，去膜衣研钵磨粉，700 mL 0.5%羧甲基纤维素钠试剂溶解，超声混匀30 min，4 ℃保存；②实验分组、灌胃方法及采集血样：SD大鼠重约200～240 g，随机分为10只对照组(0.5%羧甲基纤维素钠试剂)、30只实验组(复方黄黛片混悬液)，按照人和大鼠的体表面积进行换算，大鼠每100 g给药1 mL，配制药液浓度。连续灌胃3天，每天2次。第3天末次灌胃1 h后，大鼠每克给药0.007 mL 20%乌拉坦，腹主动脉取血，放置4 ℃冰箱2 h，5 000 r·min-14 ℃离心10 min，取血清存-80 ℃冰箱；③浓缩含药血清：取血清及其3倍量甲醇混合，涡流混合器充分混匀40 s，4 ℃ 10 000 r·min-1离心10 min，取上清液分装，氮气吹干液体得到干粉，培养基溶解干粉，制备的含药血清4 ℃保存。

2.2 含药鼠血清对HL-60细胞的影响

2.2.1 光镜下HL-60细胞形态 HL-60细胞培养于10%小牛血清1640细胞培养液，37 ℃、5%二氧化碳培养箱中连日孵育细胞。观察细胞生长状态，培养细胞至对数生长期，接种细胞密度5×105个/mL于6孔板中，分别加入含药血清0、10、20、40 μL，添加培养液使每孔溶液体积为1.5 mL，砷最终作用细胞浓度0、10、20、40 μg·L-1。24 h对照组和实验组拍照，分析细胞生长状态。

2.2.2 CCK-8法测细胞增殖 观察细胞生长状态，培养细胞至对数生长期，接种细胞密度5×104个/mL于96孔板中，分别加入含药血清0、0.625、1.25、2.5、5、10 μL，添加培养液使每孔溶液终体积为100 μL，每个浓度设计6个复孔，避免边缘效应，边缘每孔添加100 μL无菌PBS，砷最终作用细胞浓度0、10、20、40、80、160 μg·L-1。24 h后加10 μL CCK-8试剂，培养3 h酶标仪测定450 nm处每孔吸光度。

细胞生长抑制率(%)=[(对照组吸光度-给药组吸光度)/(对照组吸光度-空白组吸光度)]×100%

2.2.3 Hochest/Calcein-AM/PI荧光染色 取1 mL Hochest染液、1 μL Calcein-AM染液、1 μL PI染液混匀，避光现用现配。细胞培养接板同“2.2.1”法。24 h后1 500 r·min-1离心3 min，PBS洗3次，去上清；1 mL PBS重悬细胞，吸120 μL混合液，37 ℃水浴避光孵育20 min，1 500 r·min-1离心3 min，PBS洗3次，荧光显微镜观察细胞状态。

2.2.4 流式细胞仪分析细胞凋亡 细胞培养接板同“2.2.1”法。5 h后1 000 r·min-1离心5 min，去上清冷PBS冲散细胞，1 000 r·min-1离心5 min，重复两次，1×Binding Buffer打散细胞，取100 μL加5 μL Annexin V-FITC，室温避光10 min，加5 μL PI，室温避光5 min，加390 μL PBS，流式细胞仪测定。

2.2.5 Western Blot测定凋亡蛋白 细胞培养接板同“2.2.1”法。提取不同给药浓度的蛋白结合1×loading，制胶上样电泳，转膜牛奶封闭，孵育一抗过夜，PBST洗3次，二抗孵育1 h 30 min，PBST洗3次，显影液上机测定。

2.2.6 统计学意义 使用软件SPSS统计17.0版本对实验数据进行分析整理，通过单样本t检验、配对t检验分析各组数据，各组实验结果来自3次重复平行实验，实验结果数值以(平均数±标准差)表示，计算分析所得P<0.05时，实验数据具有统计学意义。

3 实验结果

3.1 含药血清砷浓度测定

250 μL血清、4 mL浓盐酸和浓硝酸混合溶液(浓盐酸∶浓硝酸=1∶3)于平底试管，恒温加热板220 ℃消解，dd H2O定容5 mL定容瓶，电感耦合等离子体发射光谱仪测砷的浓度，测定砷浓度为10 μg·L-1。

3.2 含药血清对HL-60细胞凋亡的影响

3.2.1 含药血清对HL-60生长的影响 图1中含药血清中砷浓度为0 μg·L-1时可见HL-60细胞成圆形，细胞生长形态略紧密，细胞边缘清晰完整，细胞形态大小较均一，可见较好的细胞活性。随着给药浓度依次增加，细胞生长趋势越来越松散，细胞边缘模糊甚至破碎，部分细胞形态比正常细胞胞体变大，含药血清浓度越大对细胞生长抑制程度越大。

图1 不同浓度含药血清对HL-60细胞形态学影响(μg·L-1)

3.2.2 CCK-8法检测HL-60细胞增殖结果 24 h后CCK-8法测定不同含药血清对HL-60细胞抑制率为1.25%、8.74%、47.45%、68.11%、75.62%，如图2所示。

图2 不同浓度含药血清作用于HL-60细胞CCK-8法抑制率结果

3.2.3 Hochest/Calcein-AM/PI荧光染色结果 Hochest染细胞核DNA激发蓝色荧光；Calcein-AM透过活细胞，激发绿色荧光；PI通过受损细胞膜结合DNA激发红色荧光。含药血清浓度的增加，活细胞的绿色荧光数量上逐渐减少，荧光强度减弱；红色荧光增多增强，如图3所示。

图3 不同浓度含药血清作用于HL-60细胞染料Hochest/Calcein-AM/PI染色结果(μg·L-1)

3.2.4 流式细胞仪测定细胞凋亡结果 Annexin V-FITC/PI双染HL-60细胞，5 h空白组细胞存活率为91.4%。随着含药血清浓度增大，HL-60细胞总凋亡率依次升高，如图4所示。

图4 不同浓度含药血清作用于HL-60细胞Annexin V-FITC/PI双染的凋亡结果

3.2.5 Western Blot凋亡蛋白结果 Bax蛋白给药组与对照组相比表达呈上升趋势，Bcl-2蛋白表达呈下降趋势，凋亡标志性蛋白Caspase 3、Caspase8蛋白表达逐一降低，Cleaved Caspase 3、Cleaved Caspase 8蛋白表达逐一上升，与对照组相比具有显著性差异，如图5、图6所示。

图5 不同浓度含药血清作用于HL-60细胞凋亡蛋白Bax，Bcl-2表达0.05，**P<0.01)

图6 不同浓度含药血清作用于HL-60细胞凋亡蛋白Caspase-3，8，Cleaved Caspase-3，8表达

4 讨论

凭借黄世林教授多年对中外文献的研究，受到张从正理论“治病先去邪，邪去而元气自复”的启发，从而确立了“扶正祛邪”的治则，选取青黛、雄黄、丹参和太子参为配伍处方的制剂，命名为复方黄黛片[1]。复方黄黛片中雄黄是君药，研究表明雄黄具有抗肿瘤作用，并已成功地应用于急性和慢性粒细胞白血病的治疗[2-4]。青黛为臣药，其有效成分为靛玉红，可以有效抑制K562细胞、HL-60细胞的增殖[5-6]，靛玉红少数发明也为白血病专利[7]，临床数据更证实了其治疗慢性粒细胞白血病有很好的疗效[8]。丹参、太子参为佐使药，用其可缓解术后白细胞减少症状，丹参酮ⅡA是有效成分，可抑制白血病细胞生长[9]。

以复方黄黛片法(RIF)为主，治疗急性早幼粒细胞白血病(APL)患者，复发率低，无复发生存率较高，其缓解后治疗方案有效可行[1，10-11]。RIF对APL治疗及其肝功能异常等不良反应和全反式维甲酸法(ATRA)、三氧化二砷法(ATO)临床效果相当，但RIF对于凝血功能异常发生率明显低于ATRA、ATO[12-13]。砷剂应用于儿童APL治疗期的血砷浓度在有效范围内，停药时砷浓度达高峰，停药后逐步降低，停药半年与治疗前水平相同，砷剂在APL治疗中具有安全可靠性[14]。复方黄黛片属于砷剂，是治疗白血病的方法之一，当复方黄黛片纳入医保目录后，复方黄黛片相较于注射用砷剂治疗APL性价比更高[15]。RIF与ATO相比疗效没有显著性差异，RIF可以使PML-RARα基因持续阴性，RIF维持治疗效果较好。肝肾功能损害没有显著性差异，但RIF比ATO不良事件发生率低，RIF可以不住院治疗，比ATO药物费用低[16]，RIF优于ATO，同时也减轻患者在化疗期间的不适感，提高患者对RIF治疗方案的依从性[17]。RIF比ATRA完全缓解(CR)率稍高，CR时间稍长，显示出更好的安全性，改善了生活质量并降低患者的医疗成本[18]。

中药治疗相对缓和，但复方中药成分比较复杂，直接作用于细胞没有经历体内药物入血过程没有说服性，因此，应用含药血清药理学方法进行体外实验。日本学者Hiroko Iwama等[19]在1987年完善了血清药理学的概念，上世纪90年代王喜军[20]研究得出“中药血清药物化学研究方法”。本实验制复方黄黛片含药血清作用于急性粒白血病细胞并观察对其的影响。由“3.1”可知，血清砷浓度为10 μg·L-1。作用于HL-60细胞24 h后光镜观察，细胞胞体变大，细胞边缘模糊甚至破裂，给药浓度变大数目变少。24 h后加CCK-8溶液，CCK-8溶液中含有WST-8，与细胞线粒体中的脱氧酶作用下结合1-Methoxy PMS生成黄色Formazan，活细胞越多生成的黄色产物越多，OD值越大。CCK-8试剂随给药浓度上升，OD值降低，药物对细胞抑制率增强。Hochest/Calcein-AM/PI混合液染HL-60细胞，Hochest透过完整细胞染细胞核DNA，激发蓝色荧光；Calcein-AM透过活细胞细胞膜与内在酯酶脱AM基团，Calcein激发绿色荧光；PI通过受损细胞膜结合DNA双螺旋，激发红色荧光。含药血清浓度增加，活细胞绿色荧光数量逐渐减少，荧光强度减弱；红色荧光增多增强。Annexin V-FITC/PI双染HL-60细胞，活细胞中细胞膜脂质内侧存在磷脂酰丝氨酸，细胞凋亡早期脂膜内侧外翻，AnnexinV与磷脂酰丝氨酸结合，检测细胞早期凋亡，PI透过不完整的细胞膜，凋亡中晚期和死亡细胞PI易侵入，总凋亡率随给药浓度增加而升高。血清浓度增加凋亡蛋白Bax、Cleaved Caspase-3和Cleaved Caspase-8表达上调，Bcl-2、Caspase-3和Caspase-8表达下调。表明复方黄黛片含药血清剂量增多，浓度升高，可诱导细胞凋亡程度明显提高，抑制HL-60细胞增殖能力显著增强。

5 结论

①复方黄黛片制成混悬剂，灌胃大鼠得含药血清，取250 μL血清，消解后H2O定容5 mL定容瓶，电感耦合等离子体原子发射光谱仪测定砷的浓度10 μg·L-1；②不同浓度作用于HL-60细胞体外实验，通过光镜观察、CCK-8法、Hochest/Calcein-AM/PI染色法、Annexin V-FITC/PI双染法、Western Blot法，含药血清浓度增加，诱导HL-60细胞凋亡程度增强；③复方黄黛片可以通过血清药理学方法制备成含药血清作用于体外实验，解决了中药组方直接作用于细胞实验溶液的不稳定性和结果的不确定性。