玉女煎含药血清对胰岛β细胞株INS-1增殖和凋亡的影响研究

林秀鸿，陈鑫颖，江睿轩，沈陈沂，何才姑

(福建中医药大学 中西医结合学院，福建 福州 350122)

国际糖尿病联盟(International Diabetes Federation，IDF)2017年12月最新数据显示，全球的糖尿病患者已达4.25亿人，相当于每11个成年人中就有1个人患有糖尿病，糖尿病(发病率为8.8%)的形势严峻。而Ⅱ型糖尿病(Type 2 diabetes mellitus，T2DM)占糖尿病的95%，是主要的流行形势。尽管各种降血糖药物以及胰岛素对血糖调节的效果很好，不少患者的病情仍然持续进展并出现各种并发症。T2DM主要的发病机制是胰岛素抵抗和胰岛β细胞功能损伤[1]，但是仅仅胰岛素抵抗并不会导致T2DM，据研究T2DM病人β细胞数量减少，说明胰岛β细胞功能损伤在T2DM的病理过程中起重要作用。因此，研究胰岛β细胞的增殖与凋亡机制成为防治糖尿病的重要途径。

T2DM是临床上常见的内分泌疾病，以“三多一少”(多饮、多尿、多食及身体消瘦)为主要特征。中医称Ⅱ型糖尿病为“消渴”，临床上胃热阴虚型较多见，常用滋阴清热的方法来进行治疗，故常运用玉女煎加减[2]。《景岳全书》中记载的经方“玉女煎”在临床上广泛用于治疗糖尿病并获得较为满意的效果，且对糖脂代谢也有一定的影响，但目前玉女煎对胰岛β细胞的作用以及如何减缓糖尿病的病情研究很少，对增殖和凋亡的调节机制不太明确。因此，本实验对玉女煎含药血清对胰岛β细胞株INS-1增殖和凋亡的影响进行相关研究，现报告如下。

1 材料与仪器

1.1 材料

1.1.1 动物及细胞株 SPF级Wistar雄性大鼠50只，8周龄，体质量180～220 g，购自上海斯莱克动物实验有限责任公司，许可证号：SCXK(沪)2007～0005，合格证号：0063771。饲养于福建中医药大学动物实验中心屏障系统。大鼠胰岛β细胞株INS-1，购自北京北纳创联生物技术研究院。

1.1.2 药物的制备 玉女煎来自《景岳全书》，60 kg成年人每日剂量：生石膏15 g、熟地黄30 g、麦冬6 g、知母4.5 g、牛膝4.5 g。按体表面积，大鼠每日每千克体重的剂量约为人的6.25倍。按量称取玉女煎各组分，加水1 000 mL，浸泡2 h，武火煮开，文火煎煮50 min，将药液倒出，加水500 mL，二次煎煮15 min，将药液倒出并与第1次药液混合，浓缩成0.625 g生药/mL的混悬液，4 ℃保存。

1.1.3 含药血清的制备 SPF级Wistar大鼠50只，适应性饲养1周，分两组，30只大鼠用玉女煎灌胃(6.25 g·kg-1·d-1)，其余20只大鼠用生理盐水灌胃，连续灌胃6 d，末次灌胃1 h后，20%乌拉坦麻醉(0.5 mL/100 g)，腹主动脉取血，4℃静置6 h后离心，3 500 rpm，15 min，吸取血清，56 ℃灭活，0.22 μm滤膜过滤后分装。

1.1.4 细胞培养 RPMI1640培养液中添加10%的胎牛血清、1%的青霉素和链霉素以及50 μmol的β-巯基乙醇，在饱和湿度、37 ℃、5% CO2的培养箱中培养，2～3 d更换培养液，细胞贴壁生长至70%～80%时，0.25%胰酶消化、传代。

1.2 试剂与仪器

RPMI1640培养液(美国gibco公司，批号：8118164)；MTT试剂(瑞士罗氏，批号：11465007001)；DPBS(美国gibco公司，批号：8118006)；胎牛血清(美国gibco公司，批号：1982158C)；ELx800酶标仪(美国 BioTek公司)，流式细胞仪(美国BD公司)。

2 方法

2.1 生长曲线的测定

在96孔板中接种密度为1.5×105/mL，5个复孔，用MTT法分别测定第1天至第8天的A590值。

2.2 MTT检测细胞的增殖

用0.25%胰酶消化细胞，稀释至密度为1×105/mL，接种至96孔板，每组做5个复孔。当细胞生长至对数生长期时，分别用5%、10%、15%和20%的玉女煎含药血清干预，对照组用20%生理盐水含药血清。用MTT法进行检测，分别测量药物作用24 h、48 h和72 h后对INS-1细胞增殖情况，重复实验3次。

2.3 流式细胞术检测细胞凋亡

在6孔板中接种细胞密度为1×105/mL，分别加浓度为5%、10%、20%的玉女煎含药血清，同时做空白对照以及生理盐水含药血清对照。

3 结果

3.1 INS-1细胞株生长曲线

INS-1细胞株在第1～2天处于生长滞留期，在第3天进入对数生长期，第7天进入平台期，故INS-1细胞对数生长期为第3～6天，见图1。

图1 INS-1细胞株生长曲线

3.2 MTT检测细胞增殖情况

药物干预24 h后，5%、10%和15%的玉女煎含药血清均可显著促进细胞增殖(P<0.05)，干预48 h和72 h后，只有10%组继续显著促进细胞增殖(P<0.05)。其余各组差异没有统计学意义。见表1。

组别含药鼠血清(%)例数A590对照组24h2031.26±0.24对照组48h2031.86±0.21对照组72h2032.18±0.30玉女煎24h2015103331.21±0.301.57±0.11∗1.95±0.10∗531.80±0.27∗玉女煎48h2031.79±0.401531.87±0.251032.04±0.03∗531.91±0.14玉女煎72h2032.18±0.161532.28±0.301032.56±0.30∗532.08±0.28

注：与同时点对照组比较，*P<0.05。

3.3 流式细胞术检测细胞凋亡情况

与对照组比较，药物作用24 h和48 h后，玉女煎各组显著抑制细胞凋亡(P<0.01或P<0.05)，并且与玉女煎24 h 10%组比较，玉女煎48 h 10%组抑制凋亡作用更明显，差异有统计学意义(P<0.05)，见表2、图2。

组别含药鼠血清(%)例数凋亡率(%)对照组24h20331.610±3.87对照组48h20332.793±5.72

续表2

组别含药鼠血清(%)例数凋亡率(%)玉女煎24h玉女煎48h201052010533333318.893±5.02∗20.775±3.65∗11.786±5.63∗20.695±8.25∗13.095±3.87∗△13.360±4.05∗

注：与相同时点对照组比较，*P<0.01，P<0.05；与玉女煎24 h 10%组比较，△P<0.05。

注：A、B.阴性对照～不加染料；C.对照组；D.玉女煎24 h(20%)；E.玉女煎24 h(10%)；F.玉女煎24 h(5%)；G.玉女煎48 h(20%)；H.玉女煎48 h(10%)；I.玉女煎48 h(5%)。

图2 给药24 h、48 h后流式细胞术检测INS-1凋亡情况

4 讨论

从接种1×104/孔的96孔板细胞生长曲线结果可知INS-1细胞前2天生长缓慢，从第3天进入对数生长期，第7天进入平台期。因此，在后续检测细胞增殖和凋亡时均在第3天给药，此时最能检测玉女煎含药血清对该细胞的作用。

据研究，胰岛β细胞数量减少和功能失调决定了T2DM发生发展的进程[3-4]。目前，我国已成为世界上Ⅱ型糖尿病患者人数最多的国家[4]。而研制安全有效、价格低廉的防治糖尿病的药物已成为研究热点和难点[5-8]。近年来，中医药在防治Ⅱ型糖尿病方面已取得明显进展[2]。灵芝提取物FYGL能促进胰岛β细胞增殖且能诱导胰岛β细胞损伤[9]；地骨皮醇提液对高糖损伤的胰岛β细胞有保护作用[10]。

玉女煎具有清胃热、滋肾阴之功效。在现代药理研究中，君药知母、臣药熟地黄及使药牛膝分别具有改善Ⅱ型糖尿病症状、解热、抗炎作用。君药知母能够降低血糖，改善胰岛素抵抗，降低血脂，拮抗动脉粥样硬化[11-13]。双苯吡酮类是知母中重要的化合物，而芒果苷和新芒果苷是知母中主要的双苯吡酮类成分，芒果苷是知母中主要的抗炎、抗病毒和抗氧化成分[14]，芒果苷和新芒果苷还有降血糖和改善Ⅱ型糖尿病症状的作用[15]。臣药地黄中含有苷类、黄酮类等化学成分[16]，黄酮类化合物是一类重要的含氧杂环天然有机化合物，具有抗炎、抗菌的作用；一些苷类化合物能够有效地降低血糖，改善血脂水平[17]。使药牛膝中小檗碱是其中的化学成分之一[18]，可以改善葡萄糖的摄取和利用，减少脂肪的生成、糖原分解和糖异生的水平[17]。同时，牛膝中的三萜及蜕皮甾酮具有可抑制由药物引起的血糖升高、降血脂、免疫调节、强心等作用[19-21]。

由本研究可知，10%玉女煎含药血清作用24 h、48 h、72 h均能促进细胞增殖，5%和15%含药血清作用24 h促进细胞增殖；玉女煎含药血清各组作用24 h均能显著抑制细胞凋亡，10%组作用48 h后，继续抑制细胞凋亡。虽然玉女煎含药血清能有效促进INS-1细胞增殖并减少其凋亡，但其抑制凋亡和促进增殖的分子机制，以及通过什么信号通路调节，这些都有待进一步实验阐明。