脱氮复合菌群的构建及其效果*

2020-07-01毕江涛

环境污染与防治 2020年6期

李菡毕江涛

(1.宁夏大学农学院，宁夏银川 750021； 2.宁夏大学环境工程研究院，宁夏银川750021)

随着我国渔业向集约化、高密度养殖模式发展，养殖水域氮污染加剧。近年，我国江河重要渔业水域主要污染指标为总氮，湖泊和水库重要渔业水域主要污染指标为总氮、总磷和高锰酸盐指数[1]。水体氮污染会造成溶解氧下降并形成亚硝胺等致癌物质[2]，对生态环境和人体健康造成严重影响。生物脱氮技术以无二次污染、安全高效等优点被认为是水体除氮的有效方法[3]。微生物可利用氮污染物为自身提供营养，并将其转化为N2等无害物质，从而达到去除氮污染的目的[4]32。部分研究发现[5-7]，针对不同类型的氮，不同菌株的脱氮能力各不相同。相关研究显示，利用单一菌株处理污染水体，存在菌株存活率较低、净化不完全等缺陷，将功能不同且无拮抗作用的菌株进行复合，形成复合菌群，通过复合菌群菌株间的功能互补形成一个较稳定的微生态系统，从而对水体中各种形式的氮都具有良好的去除效果，使得水处理效率和持久性明显提高[8-10]。赵思琪等[11]利用3株高效异养硝化菌构建出复合菌群YM，研究发现YM的脱氮效果明显好于单株菌。此外，复合菌群与单一菌株相比，适应性更强[12-13]，负荷能力更高[14]，对于强化生物脱氮和实际处理含氮废水具有更强的优势。本研究以脱氮能力为指标，对分离自鱼池养殖废水的3株脱氮菌进行复配和优化，并分析不同碳源对复合菌群生长和脱氮性能的影响，以期为养殖水体氮污染治理提供数据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株

目标菌株分离自鱼池养殖废水，经脱氮能力分析，筛选出3株脱氮性能较好的菌株，菌株编号分别为LAB004、AD012和NSP101。

1.1.2 培养基

芽孢杆菌(NA)培养基：蛋白胨10.00 g/L，氯化钠5.00 g/L，牛肉浸膏5.00 g/L，琼脂15.00 g/L，pH为7.2～7.4[15]。

溴百里酚蓝(BTB)培养基：硝酸钾1.00 g/L，L-天冬酰胺1.00 g/L，磷酸二氢钾1.00 g/L，氯化亚铁0.05 g/L，氯化钙0.20 g/L，硫酸镁1.00 g/L，BTB溶液1 mL(10 g/L酒精溶液)，琼脂20.00 g/L，pH为7.3[16]。

氨氧化菌培养基：硫酸铵2.00 g/L，磷酸氢二钾0.75 g/L，磷酸二氢钠0.25 g/L，硫酸镁0.01 g/L，硫酸锰0.03 g/L，碳酸钠0.12 g/L，琼脂20.00 g/L,pH为8.2[17]。

LB液体培养基：酵母粉5.00 g/L，蛋白胨10.00 g/L，氯化钠10.00 g/L，pH为7.4[18]。

以上培养基的灭菌条件为：121 ℃湿热灭菌30 min。

1.2 方法

1.2.1 人工废水配制

参照文献[19]配制人工废水：硫酸铵0.05 g/L，柠檬酸钠0.10 g/L，磷酸氢二钾0.02 g/L，亚硝酸钠0.02 g/L，葡萄糖1.00 g/L，pH为7.0～7.2。

1.2.2 菌株的鉴定

将菌株保存于相应的斜面培养基上，送至上海某生物工程有限公司测序，将获得的基因序列进行 BLAST同源性检索并提交至GenBank获取登录号。

1.2.3 复合菌群的构建

将3株菌分别接种于LB液体培养基中，于30 ℃、150 r/min条件下培养72 h后，离心(5 000 r/min，7 min)获得湿菌体，用0.9%(质量分数)生理盐水洗涤2次，加无菌水调制成在600 nm处的吸光度(OD600)为1.00的菌悬液。以各菌株的菌悬液在复合菌悬液中所占的体积分数为因素，每个因素设4个水平进行正交试验，按照L16(43)正交试验表进行试验设计，将不同比例混合的复合菌群悬液各取10 mL加入200 mL人工废水中，在30 ℃、150 r/min条件下处理72 h后，测定废水中氨氮、亚硝酸盐氮和硝酸盐氮的浓度，正交试验因素水平表见表1。

表1 因素水平表

1.2.4 复合菌群的生长条件优化

试验采用3因素3水平正交设计，共有9个处理组，以接种量(体积分数)(记为A)、C/N(质量比，记为B)、pH(记为C)3个环境变量参数为因素，每个环境变量参数有3个水平。按照正交试验设置，将构建的复合菌群的菌悬液，加入200 mL人工废水中，在不同环境因素下，考察72 h时废水中氨氮、亚硝酸盐氮和硝酸盐氮的浓度，以筛选出最佳的环境参数组合。试验因素水平表见表2。

表2 生长条件优化的正交试验设计

1.2.5 不同碳源对复合菌群生长和脱氮的影响试验

分别以乙酸钠、麦芽糖、蔗糖和葡萄糖为唯一碳源，按照环境条件优化试验筛选出的最佳C/N和pH配置人工废水各200 mL，以最佳接种量将复合菌悬液加入人工废水中，每个处理3个重复，在30 ℃，150 r/min 条件下培养72 h，取样测定OD600和氨氮、亚硝酸盐氮及硝酸盐氮的浓度。

1.2.6 水质指标检测

参照文献[20]，水体中氨氮、亚硝酸盐氮和硝酸盐氮分别采用纳氏试剂光度法、 N- (1-萘基) -乙二胺光度法和酚二磺酸光度法测定。

2 结果与讨论

2.1 菌株鉴定

对菌株LAB004、AD012、NSP101进行16S rDNA基因序列测定，将获得的基因序列提交至GenBank，得到菌株登录号分别为MK058700、MK024661 和MK058687，并将序列在美国国家生物技术信息中心(NCBI)数据库中进行BLAST同源性检索，初步鉴定菌株LAB004为枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)、菌株AD012为耳炎假单胞菌(Pseudomonasotitidis)、菌株NSP101为硝基还原假单胞菌(Pseudomonasnitroreducens)。

表3 不同复配比复合菌群处理废水后氮质量浓度1)

注：同一列小写字母不同表示差异显著(P<0.05)，表4同。

2.2 复合菌群构建

根据复合菌群正交试验设计L16(43)，共有16组处理，每个处理设3个重复，不同比例下菌群的脱氮效果见表3。

分析不同复配比的复合菌群处理组脱氮效果，处理7和处理3的氨氮浓度都较低，与CK比较差异显著；处理12的氨氮含量最高，与CK比较差异不显著；处理7和处理8的亚硝酸盐氮含量较低，与CK比较差异显著；处理9的亚硝酸盐氮含量较高，与CK比较差异不显著；处理3和处理7的硝酸盐氮质量浓度较低，仅0.03 mg/L，与CK比较差异显著。以上综合数据表明，处理7的脱氮效果最好，当复配比LAB004∶AD012∶NSP101=3∶2∶4(菌体体积比) 时，氨氮、亚硝酸盐氮和硝酸盐氮的浓度都较低，去除率分别达到93.40%、99.40%和99.63%，梁前才等[4]36用拟合方程分析混合菌的最佳复配比，得到沼泽红假单胞菌(Rhodopseudomonaspalustris)、枯草芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)的投加量(体积分数)为66.60%、16.70%和16.70%时，混合菌对亚硝酸盐的去除率最高，达到了99.74%，和本试验的去除效果相近。

本试验中，处理7对生物反应器脱氮的强化和实际处理含氮污水具有重要意义，并且从结果可以看出，氨氮、亚硝酸盐氮、硝酸盐氮含量总体上随着菌株AD012接种水平的增加呈现出上升的趋势，说明菌株AD012的比例过大会降低脱氮效率。

2.3 复合菌群的生长条件优化

复合菌群生长条件优化正交试验共有9组处理，每个处理3个重复，以优选出最佳的环境参数组合。试验不同处理氨氮、亚硝酸盐氮和硝酸盐氮的测定结果见表4，通过极差分析法[21-22]对表4中的数据进行分析，分析结果见表5。

通过表4得到该复合菌群脱氮的最佳条件为接种量=8%、C/N=15、pH=7.0，在该条件下复合菌群的脱氮效果较好，氨氮、亚硝酸盐氮和硝酸盐氮的质量浓度都较低。由极差分析结果可知，在各因素对氨氮含量的影响中，C/N>pH>接种量，最佳处理组合为：接种量=6%、C/N=15、pH=7.0；各因素对亚硝酸盐氮含量的影响表现为pH>接种量>C/N，最佳处理组合为:接种量=8%、C/N=10、pH=7.0；各因素对硝酸盐氮含量的影响表现为C/N>pH>接种量，最佳处理组合为：接种量=8%、C/N=10、pH=7.0，在实际应用中可根据氮化合物的种类选择具体的环境条件。

2.4 不同碳源对复合菌群生长和脱氮效果的影响

把按照菌体体积比为LAB004∶AD012∶NSP101=3∶2∶4混合组成的复合菌群菌悬液，各取16 mL分别加入不同碳源的废水中，测定72 h内菌群生长OD600和氨氮、亚硝酸盐氮和硝酸盐氮的浓度。

表4 复合菌群生长条件优化正交试验结果

表5 极差分析结果

2.4.1 菌群生长情况

不同碳源下菌群的生长量和生长对数期不同(见图1)，各种碳源下复合菌群在0～12 h生长速度最快，60 h后菌群生长基本稳定，变化幅度较小，乙酸钠为碳源时菌群生长对数期为0～18 h，麦芽糖为碳源时菌群生长对数期在0～24 h，蔗糖和葡萄糖为碳源时菌群生长对数期在0～48 h。菌群在生长对数期具有繁殖能力强、酶活性高和抵抗外界不利因素的能力较强等特点，因此将处于对数期的复合菌群用于污水处理，可以减少菌群的环境适应时间，从而缩短脱氮时间，提高脱氮效率[23]。

图1 碳源对复合菌群生长的影响Fig.1 Effects of carbon sources on the growth of compound bacteria

2.4.2 氨氮

不同碳源下复合菌群在脱除氨氮的过程中，除葡萄糖外，其他碳源12 h之后氨氮浓度都有一定的上升(见图2)，但不同碳源的氨氮浓度上升幅度不同，蔗糖碳源下氨氮浓度上升幅度最大，乙酸钠碳源下氨氮浓度只有小幅度上升，但其浓度始终在其他碳源之下。72 h时，不同碳源下的氨氮去除率明显不同，在菌群去除氨氮的过程中碳源影响较大。

图2 碳源对氨氮的影响Fig.2 Effects of carbon sources on ammonia nitrogen

2.4.3 亚硝酸盐氮

本试验中与其他3种碳源相比，乙酸钠为碳源时，亚硝酸盐氮浓度一直较低且下降速率最快，在0～12 h其亚硝酸盐氮明显下降，而其他碳源在24 h后才开始出现明显下降(见图3)。所有碳源在24～48 h浓度下降幅度最大，48 h后趋于平稳，72 h时各种碳源下亚硝酸盐氮去除率均达到90%以上，其中乙酸钠碳源下复合菌群的亚硝酸盐氮去除率最高，为97.96%，亚硝酸盐氮具有致癌性，所以在生物脱氮过程中亚硝酸盐氮的去除具有重要的意义。

图3 碳源对亚硝酸盐氮的影响Fig.3 Effects of carbon sources on nitrite nitrogen

2.4.4 硝酸盐氮

乙酸钠为碳源时，硝酸盐氮浓度在0～48 h一直处于下降趋势，而在其他碳源下都呈现出先增后减的趋势，并且在该时间段乙酸钠碳源下的硝酸盐氮浓度与其他碳源相比一直较低(见图4)，72 h时以麦芽糖为碳源的硝酸盐氮去除率较差，为86.66%，乙酸钠为碳源时去除率最高达到了99.89%，以葡萄糖和蔗糖为碳源时硝酸盐氮去除率也都达到90%以上。不同碳源下，除麦芽糖为碳源时的硝酸盐氮去除率较低外，其他碳源下硝酸盐氮去除率都处于较高水平，本试验研究的复合菌群脱氮时外加碳源不宜选择麦芽糖。

图4 碳源对硝酸盐氮的影响Fig.4 Effects of carbon sources on nitrate nitrogen

结合图1至图4可以得出，相较其他3种碳源(麦芽糖、蔗糖和葡萄糖)，以乙酸钠为碳源时复合菌群的最大生长量虽不是最高，但其脱氮率较高，72 h 时氨氮、亚硝酸盐氮和硝酸盐氮去除率分别达到96.80%、97.96%和99.89%。GMEZ等[24]在地下水污染处理中，研究了不同碳源对处理效果的影响，结果表明以甲醇和乙醇为碳源时，硝酸盐氮的去除率达到了90%以上，但以蔗糖为碳源时，亚硝酸盐氮的去除率较差，以非糖类物质为碳源时的脱氮效果明显好于糖类物质，这是由于乙酸钠和醇类物质的分子量较小且结构简单易被菌体分解利用，细菌生长速率较快[25-26]，脱氮效率较高，同时，糖类物质含碳量高，微生物生长量相对非糖类物质(如乙酸钠、醇类等)更高，当细菌生长量过大时会在某种程度上影响脱氮效果[27]。另外，不同碳源下复合菌群对氨氮去除的高效时间段都集中在0～12 h，而对亚硝酸盐氮和硝酸盐氮去除的高效时间段集中在24～48 h，这与菌群的生长情况和脱氮特性有关。