基于PI3K/Akt通路探讨脉络宁注射液对早期糖尿病视网膜病变的作用

梅子寒 杨杰 王炜 曹鹏 杨艳 李鹏飞 朱可夫 江滔 张梦婷

糖尿病视网膜病变(diabetic retinopathy，DR)是一种严重的致盲性糖尿病眼部并发症。对中国1990～2017年45岁以上的糖尿病患者调查发现，DR 发病率为17.22%[1]。几乎所有病程在 10 年以上的糖尿病患者都存在不同程度的视网膜病变[2]。DR导致的失明占所有失明人数的8.9%[3]。可见，DR的患病率高，致盲率高，严重影响国民生存质量，因此早期诊断、积极治疗DR是防治糖尿病并发症病变的一项重要内容。脉络宁注射液由南京中医药大学附属中西医结合医院(江苏省中医药研究院)研制，由玄参、石斛、牛膝、金银花、党参等药物提取后制成的中药复方制剂，具有清热化阴、活血化瘀的功效[4]。大量临床研究证实该药在糖尿病视网膜病治疗方面疗效显著[5-8]。该药能抑制体外高糖诱导的视网膜血管内皮细胞凋亡，对高糖环境下的视网膜内皮细胞有保护作用[9]。DR的发生发展是由多种细胞因子参与、炎症、离子通道和信号转导代谢酶共同调控的复杂过程。PI3K/Akt通路在细胞生长、增殖，分化过程中起着重要的作用，Akt 在视网膜组织中是一个内源性的视网膜生存因子。在高糖诱导的视网膜病变模型中，高糖环境直接或间接的抑制了内源性 Akt 的生成及表达，造成视网膜血管内皮细胞的凋亡增加，增殖减少。在糖尿病发生和发展过程中，持续的高血糖能够促进PI3K/Akt通路活化，从而促使多种细胞因子合成与释放，最终加速DR的发展过程。本研究基于PI3K/Akt信号通路在维持正常视网膜内皮细胞存活中所起的关键作用[10]，我们拟从该信号通路研究脉络宁注射液防止早期糖尿病视网膜病变的作用机制，将进一步明确脉络宁注射液在DR早期的治疗作用及分子机制，并进一步为揭示DR早期病变的发病机制提供实验依据。

1 实验动物及细胞

SPF级SD雄性大鼠30只，体重200～220 g，由青岛市药检所实验动物中心提供。所有大鼠均饲养在标准化动物中心，单笼标准饲料喂养，自由进食和饮水，室温18～22 ℃。人视网膜内皮细胞HRCEC(购自北京协和库)。

2 实验试剂及设备

链脲佐菌素(Sigma公司产品)；血糖仪、血糖试纸(美国强生Lifescan公司)；脉络宁注射液(金陵药业股份有限公司南京金陵制药厂)；葡萄糖(Sigma公司产品)；DMEM培养基、胎牛血清(美国Gibco公司产品)；Akt、p-Akt、PI3K、Bcl2、caspase抗体(美国Santa Cruz公司)、二抗(美国Cell Signalling公司)；荧光定量PCR仪7500型(南京钛格威生物技术有限公司)；Odyssey近红外双色激光成像系统(美国LICOR公司)；微量移液器(艾本德公司)。

3 DR模型的建立、分组及给药

将30只SD雄性大鼠随机分为正常对照组、模型组、脉络宁组，每组10只。待各组大鼠体重在200～250 g时采用链脲佐菌素 (Streptozotocin,STZ)诱发糖尿病造模。造模前，将各组大鼠禁食12 h。用0.01 mmol/L柠檬酸盐缓冲液配成10 g/L的STZ，实验组大鼠按60 mg/kg剂量左下腹腔内注射STZ，对照组大鼠注射等量的溶剂(0.01 mmol/L柠檬酸盐缓冲液)72 h后取尾血测血糖及尿糖。凡血糖≥16.7 mmol/L及尿糖阳性的大鼠定为糖尿病模型。自造模成功后开始进行脉络宁注射液腹腔注射，每日一次，剂量为0.92 mL/kg(按照人临床给药量为10 mL,一日一次，大鼠换算系数为5.5进行剂量换算),连续给药12 w。空白对照组和模型组腹腔注射等体积的生理盐水。

4 检测磷酸化Akt蛋白在大鼠视网膜组织中的表达

给药结束时处死各组大鼠取出左侧眼球，沿着角膜缘剪开眼球的角膜，去除角膜、晶状体和玻璃体后，用眼科刀将视网膜取出。Western blot检测各组大鼠视网膜组织中p-Akt、Akt蛋白以及PI3K、Bcl2、Caspase 3水平。利用RIPA裂解液裂解4C°离心收集上清测定蛋白浓度，使用 2×还原上样缓冲液调节各组蛋白浓度一致，100℃水浴保温 5min，SDS-PAGE 电泳后，将蛋白转移到PVDF膜上，1% BSA 封闭2 h，一抗4C°振荡孵育过夜，TBST振荡清洗三次，每次5 min。二抗室温摇床振荡孵育1 h，TBST振荡清洗三次，每次5 min。HRP标记二抗用ECL显色曝光，对照Marker记录实验结果。

5 细胞实验

5.1体外培养HRCEC(人视网膜内皮细胞)

HRCEC细胞在含10% FBS的DMEM培养基中于37℃、5% CO2培养箱中进行培养。当细胞处于对数生长时，调整细胞数为 2×105/mL，每孔2 mL接种于6孔培养板中。将细胞分为三组：正常对照组、高糖组、脉络宁组。除正常对照组外，其余各组均采用25 mmol/L葡萄糖进行高糖培养来模拟体内高糖环境，同时脉络宁组加入0.8 μg/mL脉络宁注射液，处理时间均为72 h。

5.2Westen blot检测HRCEC细胞中Akt、p-Akt、PI3K、Bcl2、Caspase的蛋白水平

收集各组细胞，用PIPA裂解，4C°离心收集上清测定蛋白浓度，使用2×还原上样缓冲液调节各组蛋白浓度一致，100C°水浴保温5min，SDS-PAGE电泳后，将蛋白转移到PVDF膜上，1% BSA封闭2 h，一抗4 ℃振荡孵育过夜，TBST振荡清洗三次，每次5 min。二抗室温摇床振荡孵育1 h，TBST振荡清洗三次，每次5 min。HRP标记二抗用ECL显色曝光，对照Marker记录实验结果。

5.3检测动物实验组大鼠视网膜中的中Akt、PI3K、Bcl2和Caspase 3 mRNA水平

6 统计学方法

7 结果

7.1络宁注射液抑制HRCEC 细胞中p-Akt蛋白的表达

与正常对照组比较，高糖诱导组细胞中p-Akt蛋白水平明显增加；脉络宁给药组p-Akt蛋白表达量明显低于高糖诱导组(图一)。可见，脉络宁可以抑制高糖诱导的HRCEC 细胞中高水平的p-Akt的表达。

7.2脉络宁注射液可降低糖尿病大鼠视网膜组织中p-Akt及其上游激酶PI3K以及下游促凋亡蛋白Bcl2、Caspase蛋白水平

与正常对照组大鼠比较，糖尿病大鼠视网膜组织中 p-Akt水平明显增加，脉络宁注射液给药能抑制糖尿病大鼠中高水平的p-Akt，而AKT总蛋白在正常对照组、糖尿病组、脉络宁给药组之间无明显变化。促进Akt发生磷酸化的上游激酶PI3K以及Akt下游的促凋亡蛋白Bcl2、Caspase的蛋白水平在各组间显示出与p-Akt相同的变化趋势，由此可见，脉络宁注射液能抑制糖尿病大鼠中高水平的pAkt、PI3K、Bcl2和Caspase的蛋白表达(图1)。

图1 脉络宁给药对高糖诱导的pAkt表达的影响

7.3脉络宁注射液可降低糖尿病大鼠视网膜组织中PI3K以及促凋亡的基因Bcl2、Caspase 3的表达

通过Real-time PCR的方法对Akt上下游相关的基因的检测结果表明 AKT 的mRNA水平在正常对照组、糖尿病组、脉络宁给药组三组间的表达无显著性差异(P>0.05)(表1);与正常对照组比较，PI3K的mRNA水平在糖尿病组和脉络宁给药组中均显著升高(P<0.01)；与糖尿病组比较，脉络宁显著下调了PI3K的mRNA水平(P<0.05); Bcl2、Caspase mRNA在糖尿病组和模型组中均表达增加，脉络宁干预后其表达水平均显著降低。脉络宁注射液显著抑制了糖尿病大鼠视网膜中PI3K、Bcl2和Caspase的mRNA的表达。

图2 脉络宁给药对糖尿病大鼠视网膜组织中中各Akt相关蛋白表达的影响

Fig.2 The effect of mailuoning on the expression of Akt related proteins in diabetic rat retinal tissue

表1 各组大鼠视网膜组织中Akt、PI3K、Bcl2、caspase mRNA相对表达量比较

注：采用单因素方差分析，与空白对照组比较，##：P<0.01，###:P<0.005;与模型组比较,*：P<0.05，**：P<0.01，***：P<0.005

8 讨论

DR是糖尿病微血管病变在眼底独特环境中的表现，长期慢性的高血糖症是其发病的基础。DR发病的中心环节是高血糖症及其引起的组织缺血缺氧导致的一系列病理改变，包括视网膜微血管的渗漏、闭锁，进而造成视网膜组织水肿(尤其是黄斑水肿)、渗出、出血以及组织缺血缺氧引起的新生血管的形成，可进一步发展为玻璃体出血和牵拉性视网膜脱离，最终导致盲目[11]。DR的早期变化为视网膜的损伤，毛细血管基底膜增厚，周细胞和视网膜微血管内皮细胞(retinal microvascular endothelial cells，RMECs)丧失，其丧失的性质为细胞凋亡[12]。视网膜缺血使促血管生成物质增加，引起视网膜新生血管形成，从而导致增生性糖尿病视网膜病变的发生。周细胞对内皮细胞起支持作用，且具有收缩功能，可调节视网膜毛细血管局部的血流量和血管通透性，对于微血管结构和功能的稳定起着重要的作用；内皮细胞之间以紧密连接的方式相互连接，构成的血视网膜屏障 (blood retinal barrier，BRB)是其中最为重要的内屏障[13]。因此内皮细胞结构和功能的完整性对维持视网膜毛细血管的稳定性具有十分重要的作用，成为早期糖尿病视网膜病变治疗的关键。

PI3K/Akt信号转导通路由Akt、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(Caspase)、促凋亡因子Bad(bcl-2-associated death protein,Bad)等一系列相关因子组成，通过促进细胞生长、增殖、凋亡等生命活动，来参与糖尿病、肿瘤等多种疾病的病理过程，是体内细胞存活的一条重要的通路[14-16]。大量研究表明Akt信号通路的激活能够抑制各种各样细胞凋亡刺激所诱导的程序性细胞死亡，且显负性Akt干扰正常AKT信号能够促进生长因子诱导的细胞生存[17-20]。在高糖诱导的视网膜病变模型中，高糖环境直接或间接的抑制了内源性Akt的生成及表达，促进磷酸化Akt的产生，造成视网膜血管内皮细胞的凋亡增加，增殖及迁移减少，大量的血管内皮细胞的凋亡造成血管闭塞，形成视网膜无灌注区。本实验中，体外HRCEC细胞水平研究发现脉络宁能抑制高糖诱导的HRCEC细胞中的pAkt水平的增加。体内糖尿病模型小鼠上研究发现，脉络宁能抑制糖尿病大鼠视网膜中的高表达的pAkt并且也能抑制糖尿病大鼠中Akt的上游激酶PI3K以及下游促凋亡蛋白Bcl-2、Csapase3的基因mRNA的表达以及蛋白水平的增加。

综上所述，我们通过大鼠糖尿病模型上的体内药效试验和在人视网膜细胞HRCEC上的高糖诱导的损伤模型上的研究揭示了脉络宁注射液通过调控PI3K/Akt信号通路来介导对糖尿病视网膜细胞的保护作用从而改善早期糖尿病视网膜脉络病变的作用。