上皮性卵巢癌患者血小板中miR-19b表达的临床意义

鄢文 郭蕾 郭立兵 靳文

广东省第二人民医院1肿瘤一科，2妇科，3心血管内三科（广州510317）

卵巢癌（ovarian cancer，OC）是妇科常见的生殖系统恶性肿瘤之一，其致死率居于女性生殖系统恶性肿瘤的首位，原因在于OC 起病隐匿，缺乏积极有效的OC 早期筛查及预防手段，进展速度快，大部分OC 患者在初次就诊时已处于晚期，治疗效果和预后差［1-3］。上皮性卵巢癌（epithelial ovarian cancer，EOC）是OC 最主要的病理类型［1-3］。目前对EOC 的发病和浸润、转移机制尚不清楚，是制约EOC 防治的关键因素。

血小板是来源于骨髓成熟巨核细胞胞浆脱落的小而无核的细胞质碎片，含有microRNA、长链非编码RNA、环状RNA（circRNA）、线粒体DNA 等大量生物活性物质，介导了生理性止血、凝血功能，广泛参与了机体的免疫和炎症反应。目前认为血小板-卵巢癌细胞的交互作用可能是促进OC浸润转移的重要机制［4-6］。一方面，OC 细胞通过释放活性分子调节血小板的数量、功能以及生物活性分子的表达，促进肿瘤转移微环境的形成；另一方面，活化的血小板与OC 细胞形成聚集物，有助于促进OC 细胞浸润、转移、逃避免疫监护、耐药［4-6］。然而，血小板-卵巢癌细胞交互作用的确切分子机制尚未完全阐明。

microRNAs 是一类与血小板功能、卵巢癌浸润和转移等密切相关的一类小分子RNA。miR-19b是miR-17-92 基因簇中重要的致癌成员之一，可能与血小板聚集和活化、卵巢癌增殖和转移等密切相关［7-8］。本研究旨在探讨miR-19b 在EOC 患者外周血小板中的表达，分析其与卵巢癌分期和血小板活化和聚集功能的关系，为进一步明确miR-19b是否参与调控血小板-卵巢癌细胞的交互作用提供临床依据。

1 资料与方法

1.1 一般资料收集2018年6月至2019年10月广东省第二人民医院住院治疗的EOC 患者。纳入标准：（1）首次就诊的未行药物和手术治疗的EOC患者；（2）组织病理学明确诊断为EOC，并根据2013年修订的国际妇产科联盟（FIGO）OC 手术病理分期（FIGO Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ期）进行分组，即FIGOⅠ-Ⅱ期组、FIGO Ⅲ-Ⅳ期组。排除标准：（1）年龄＞80 岁；（2）非EOC 患者；（3）合并血液系统疾病、结缔组织疾病、动脉粥样硬化血栓性疾病、糖尿病等以及正在接受抗血小板、抗凝药物治疗的患者；（4）已行化学药物治疗、放射治疗以及手术治疗的患者；（5）拒绝参加本项目研究的患者。本研究项目已经广东省第二人民医院伦理委员会审核批准后实施。收集所有EOC 患者的临床资料，包括年龄、血常规、血清肿瘤标记物（CA125）、临床分期（FIGO 分期）、肿瘤病理分级、是否合并大网膜转移、深静脉血栓（deep vein thrombosis，DVT）等。见表1。

1.2 血栓弹力图检测血小板聚集功能于入院次日清晨以肝素抗凝管采集静脉血3 mL，采用美国TED-500 血栓弹力图检测仪检测并绘制血栓弹力图，记录凝血因子激活时间（R 值）、血块形成速率参数（K 值）、弹力图最大切角（Angle，α 值）、弹力图最大振幅（MA 值）和凝血综合指数（CI 值）。

表1 40 例EOC 患者临床和病理资料Tab.1 Clinical and pathological data of 40 EOC patients 例

1.3 流式细胞术检测血小板CD61 和CD62P（Pselectin）的表达于患者入院次日晨起时采集静脉血10 mL 加入装有1.67 mL 酸性柠檬酸葡萄糖溶液（ACD：120 mmol/L 柠檬酸钠、110 mmol/L 葡萄糖，80 mmol/L 柠檬酸）的试管中，加入终浓度10 μmol/L 吲哚美辛，室温下以200 g 离心10 min，分别吸取血浆和富血小板层血浆。血浆存储于-80 ℃冰箱。于流式阴性对照管加入5 μL 富血小板血浆、CD61-FITC、IgG1-PE，阳性对照管中加入5 μL 富血小板血浆、CD61-FITC、CD62P-PE，孵育20 min 后洗涤，采用流式细胞仪（Beckman 公司，美国）检 测CD61 阳 性（CD61+）和CD62P 阳 性（CD62P+）的表达，部分用于提取血小板RNA。计算CD62P+血小板百分比：CD61+CD62P+血小板数/CD61+数×100%。

1.4 DVT 的检测所有患者无论是否合并存在下肢肿胀、增粗、疼痛等症状，均行经静脉超声检查、64 排螺旋CT 静脉血管成像、核磁共振血管成像等检查以明确诊断是否合并存在DVT。

1.5 实时荧光定量PCR 法检测血小板miR-19b的表达加入终浓度为0.1 μg/mL 前列环素至富血小板血浆（PRP），室温下以1 000 g 离心10 min，弃去上清液，管底沉淀物为血小板。采用miRNeasyTM Mini Kit 试剂盒提取血小板总RNA，具体操作按照试剂盒说明书进行。实时荧光定量PCR法检测血小板miR-19b（上游、下游引物序列分别为：5′-UGUGCAAUCCAUGCAAAACUGA-3′、5′-GCTCACTGCAACCTCCTCCTCC-3′）的表达，U6（上游、下游引物序列分别为：5′-GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT-3′、5′-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT-3′）作为内参，具体操作步骤同课题组既往研究［9］。试验独立重复3 次，采用2-ΔΔCt方法计算miR-19b 的相对表达量。

1.6 统计学方法采用Graphpad Prism 8 统计软件进行数据分析。对于计量资料以x ± s表示，两组间样本比较则采用独立样本t检验。对于计数资料以例数或百分比表示，两组间计数资料的比较则采用χ2检验。Pearson 相关性分析评价血小板miR-19b 与血小板计数、血小板聚集和活化指标的关系。Pearson 相关性分析评价血小板miR-19b 与DVT 事件的关系。P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 FIGOⅠ-Ⅱ期组和FIGO Ⅲ-Ⅳ期组EOC 患者血小板聚集功能和活化比例的分析 血栓弹力图检测结果显示：与FIGO Ⅰ-Ⅱ期组相比，FIGOⅢ-Ⅳ期的R 值、K 值降低（P＜0.05），MA 值、CI值明显升高（P≤0.001），Angle 值无明显变化（P=0.332）。血常规检测结果显示：与FIGO Ⅰ-Ⅱ期组相比，FIGO Ⅲ-Ⅳ期组血小板计数明显升高（P＜0.001）。流式细胞术检测结果显示：与FIGOⅠ-Ⅱ期组相比，FIGO Ⅲ-Ⅳ期组血小板CD62P 阳性率明显升高（P ＜0.001）。见表2。

表2 EOC FIGO Ⅰ-Ⅱ期组和FIGO Ⅲ-Ⅳ期组间血小板聚集和活化比例的比较Tab.2 Comparison of platelet aggregation and activation function between EOC FIGO Ⅰ-Ⅱgroup and FIGO Ⅲ-Ⅳgroup ±s

表2 EOC FIGO Ⅰ-Ⅱ期组和FIGO Ⅲ-Ⅳ期组间血小板聚集和活化比例的比较Tab.2 Comparison of platelet aggregation and activation function between EOC FIGO Ⅰ-Ⅱgroup and FIGO Ⅲ-Ⅳgroup ±s

注：FIGO，国际妇产科联盟；R，凝血因子激活时间；K，血块形成速率参数；Angle（α 值），弹力图最大切角；MA，弹力图最大振幅；CI，凝血综合指数

R（min）K Angle（°）MA（mm）CI血小板计数（×109）CD62P 阳性率（%）FIGO Ⅰ～Ⅱ期（n=10）5.26±1.01 2.07±0.57 65.49±6.58 57.95±5.99 1.06±0.39 232.4±36.16 30.71±13.43 FIGO Ⅲ～Ⅳ期（n=30）4.41±0.99 1.61±0.54 69.27±7.17 67.99±3.51 1.91±0.73 298.3±48.07 49.67±8.72 t 值2.328 2.305 0.983 6.502 3.511 3.964 5.173 P 值0.025 0.027 0.332＜0.001 0.001＜0.001＜0.001

2.2 EOC FIGOⅠ-Ⅱ期组和FIGO Ⅲ-Ⅳ期组的临床资料和血小板miR-19b 的表达 临床资料显示：患者年龄、病理分级、DVT 事件在FIGO Ⅰ-Ⅱ期组、FIGO Ⅲ-Ⅳ期相比均无明显差异（P＞0.05）。定量PCR 检测结果显示：与FIGO Ⅰ-Ⅱ期组相比，FIGO Ⅲ-Ⅳ期组血小板miR-19b 表达明显升高（P＜0.001）。见表3。

2.3 EOC 患者血小板miR-19b 水平与血小板计数、聚集功能和活化比例、CA125 以及DVT 事件等的相关性分析Pearson 相关性分析显示：血小板miR-19b 表达水平分别与MA、CI、血小板计数、血小板CD62P 阳性率、CA125 呈正相关（P≤0.001），与K 值呈弱负相关（r=-0.336，P= 0.034），与R、Ang 值无明显相关（P＞0.05）。Spearman 相关性分析显示血小板miR-19b 表达水平与DVT 事件呈正相关（r=0.730，P＜0.001）。见表4。

表3 EOC FIGO Ⅰ-Ⅱ期组和FIGO Ⅲ-Ⅳ期组间临床资料和血小板miR-19b 水平的比较Tab.3 Comparison of clinical data and platelet miR-19b levels between EOC FIGO Ⅰ-Ⅱgroup and FIGO Ⅲ-Ⅳgroup x±s，n

表4 EOC 患者血小板miR-19b 水平与血小板计数、聚集和活化、CA125、DVT 事件等指标的相关性分析Tab.4 Correlation analysis of the relationship between miR-19b expression and platelet count，aggregation and activation index of platelet，and CA125 in all EOC patients

3 讨论

图1 血栓弹力图检测血小板聚集功能Fig.1 Platelet aggregation function was detected by Thrombelastogram

OC 细胞早发转移是EOC 治疗失败和死亡的主要原因之一［1-3］。血小板作为肿瘤微环境中的重要分子，可能在促进OC 细胞早发转移中发挥重要作用［6，10］。本研究结果显示：与FIGO Ⅰ-Ⅱ期组相比，FIGO Ⅲ-Ⅳ期组循环血小板计数表达明显升高，血栓弹力图指标R 值、K 值降低（P＜0.05），MA值、CI 值升高（P≤0.001），血小板活化比例显著升高（P＜0.001），提示晚期EOC 患者血小板计数增多、活化和聚集功能增强（图1）。临床和基础研究明确血小板计数增加与卵巢癌细胞分泌IL-6 诱导肝细胞分泌促血小板生成素刺激骨髓产血小板增加等密切相关［11］，是OC 患者不良预后的独立预测因子［12］，与OC 无进展和/或总体生存状况恶化相关［11］。血小板活化与卵巢癌细胞分泌血栓素A2和二磷酸腺苷、表达组织因子活化凝血酶等密切相关［13］。本研究和国外相关研究结果提示循环血小板计数增多、活化和聚集功能增强，与EOC 转移和进展密切相关。

多数研究认为活化、聚集的血小板可能通过：（1）包绕循环肿瘤细胞（circulating tumor cells，CTCs）形成癌栓，保护CTCs 免受血流剪切力杀伤，逃避免疫监视，促进OC 细胞的血行转移；（2）诱导卵巢癌细胞发生上皮间充质转化以促进OC 细胞向远处转移和产生化疗抵抗；（3）介导OC 细胞黏附、滞留和跨血管转移［13-14］。最近研究［15］发现血小板微粒源性miR-939 能够促使EOC 发生上皮间质转化，促进EOC 的转移。然而，miR-939 在血小板中表达较低。miR-19b 是癌基因miR-17-92 基因簇成员之一，富表达于血小板中［16］。已有临床研究显示相对于单用阿司匹林抗血小板治疗，阿司匹林联合双嘧达莫或氯吡格雷等双联抗血小板治疗48 h 后血小板miR-19b 表达显著下调［8］，提示miR-19b 与双联抗血小板等药物抑制血小板聚集、活化功能密切相关。本研究结果显示：与FIGOⅠ-Ⅱ期组相比，外周血小板miR-19b 的表达水平在FIGO Ⅲ-Ⅳ期组显著升高（P＜0.001），并且与MA、CI、血小板计数、血小板CD62P 阳性率、CA125等存在显著正相关，与K 值呈弱负相关，提示miR-19b 与晚期EOC 患者血小板的活化、聚集功能增强相关。

血小板WD-40重复域1（WD-40 repeat domain 1，WDR-1）是miR-19b 的潜在靶基因之一，在心血管疾病患者中表达显著降低；敲除WDR 基因的巨核细胞系MEG-01 细胞株（人类巨核细胞和血小板体外细胞模型）的活化和聚集功能显著增强［17］，提示WDR-1 能够抑制血小板的粘附和聚集功能。结合本研究结果，进一步提示miR-19b 参与促进了卵巢癌患者血小板的活化和聚集功能。此外，临床和基础研究发现miR-19b 在EOC 组织和细胞中表达升高［18-19］，与EOC 复发密切相关［19］，具有促进EOC细胞增殖和迁移的作用［18］。然而，目前尚不清楚miR-19b 在EOC 细胞与血小板交互作用中扮演何种角色，有待于进一步研究。

血小板的激活和聚集是血栓形成的关键因素。卵巢癌相关性血栓形成是卵巢癌患者的中位生存时间缩短或总体生存率降低的独立危险因素［20］。本研究结果显示：DVT 事件与血小板miR-19b 表达呈显著正相关（P＜0.001），提示miR-19b 可能参与介导了晚期EOC 患者血小板的聚集和活化以及DVT 事件；但与FIGO Ⅰ-Ⅱ期组相比，DVT 事件在FIGO Ⅲ-Ⅳ期组未见显著升高（P＞0.05），原因可能在于本研究样本量相对较少。

综上，本研究发现循环血小板miR-19b 的表达水平在晚期EOC 患者显著升高，并且与血小板数量增多、活化和聚集功能增强密切相关，提示miR-19b 可能在血小板参与促进EOC 的转移中发挥重要调控作用。本研究局限在于研究样本量相对较少，未对miR-19b 调控血小板功能的具体机制进行探讨。在今后研究中，本项目将进一步扩大样本量、通过基础实验证实miR-19b 调控血小板功能及其在EOC 转移中的作用机制。