生物传感器在水产品新鲜度检测中的应用与研究进展

徐 霞 吴笑天 徐嘉钰 胡之恒 巫丽君 丁玉庭 周绪霞

(1浙江工业大学海洋学院,浙江 杭州 310014；2国家远洋水产品加工技术研发分中心(杭州),浙江 杭州 310014)

水产品味道鲜美,营养价值高,富含蛋白质、氨基酸和脂肪等人体所需营养物质,是人们日常膳食结构中的重要组成部分,水产品产业也是我国重要的经济来源[1]。但水产品在储藏和销售过程中易受内源性蛋白酶和微生物的共同作用而发生腐败变质,使得水产品的营养价值降低,产生异味,甚至会产生有毒物质,引发食品安全问题[2]。新鲜度是反映水产品品质的重要指标,很大程度上决定了水产品的价值。目前水产品新鲜度的检测仍以传统检测方法为主,结果较准确,但存在主观性大、耗时长、操作程序复杂、需要专业人员、对产品有破坏性等缺点[3]。因此,在储藏、运输、加工和销售过程中对水产品的新鲜度进行快速检验已成为重要的研究课题,具有重要的学术价值和现实意义。

生物传感器具有快速、特异性和灵敏度高、操作简单、成本低等优势,近年来被广泛应用于水产品新鲜度的检测。生物传感技术主要是通过酶等生物识别元件对水产品在腐败过程中产生的一系列特征物质如三磷酸腺苷(adenosine triphosphate,ATP)降解产物或胺类物质产生响应,然后由换能器件将生化信号转换成可定量的电或光信号来实现对新鲜度的检测。生物元件的特异性识别功能使其能直接应用于复杂食品样品的测定[4]。

近年来随着纳米材料在传感领域的快速发展,生物传感器在水产品新鲜度检测应用方面迎来了新的突破。本文将综述生物传感器在水产品新鲜度检测上的应用及其研究进展,并概述当前研究中存在的问题和发展趋势,以供深入研究参考。

1 水产品新鲜度检测方法

根据检测技术的发展,可将水产品新鲜度的检测方法分为传统检测方法与新型检测方法(表1)。目前传统检测方法仍是主流,通常结合感官评定、物理评定、化学评定和微生物评定4 种方法中的几种或全部进行综合评价,其测定结果准确,但费时费力且难以实现现场检测。现代新型检测方法因快速、操作简单、可现场检测等优势已成为当前研究的热点,主要包括感官仿生技术、光谱技术和生物传感器技术等,其中生物传感器技术所需设备简单、可随身携带,检测耗时短且灵敏度高,在水产品新鲜度的快速检测上极具潜力。

表1 水产品新鲜度的检测方法Table 1 Detection methods for freshness of aquatic products

2 生物传感器概述

生物传感器一般都含有2 个结构：一种或数种生物敏感材料(生物识别元件)以及能把生物活性表达的信号转换成为电信号或光信号的物理或者化学换能器(信号转换器)；其主要通过生物识别元件对所检测样品的特征性物质产生响应,并通过信号转换器将这种持续、有规律性的信息转换成为人们可以理解的信息从而实现对某一种物质的测定[11],具体原理如图1所示。

根据生物分子识别元件的不同,生物传感器可分为酶传感器、微生物传感器、免疫传感器、DNA/RNA传感器、细胞传感器等；根据信号转换器的不同,可分为电化学生物传感器、半导体生物传感器、光学生物传感器、声学生物传感器等。目前,生物传感器已被广泛研究并应用于兽药残留[12]、毒素[13]、致病菌[14]、重金属[15]等威胁水产品食用安全的有害物质检测以及新鲜度等水产品品质指标的测定。

3 生物传感器在水产品新鲜度检测中的应用

生物传感器检测水产品新鲜度主要以酶为生物识别元件,并以ATP 降解产物或生物胺等物质为主要的检测目标；同时采用电化学电极(固体电极、离子选择电极和修饰电极等)作为固定载体或信号转换器,将酶等生物敏感材料固定于电极表面,用电化学电极将生物敏感材料识取的生物化学信息转化成能够处理测量的、与检测目标相对应的电信号(电流、电压、电导),从而实现对特征物质的定量测定[17]。也有少量以微生物细胞为敏感材料的电化学传感器检测水产品腐败变质程度的相关报道,在利用此生物传感器测定水产品新鲜度时,需要对水产品进行预处理以获得特征物质提取液,预处理过程主要包括酸提、均质和离心等,通常需要30 min[18]。

图1 生物传感器工作原理示意图[16]Fig.1 Schematic diagram of the working principle of biosensor[16]

3.1 酶传感器

3.1.1 ATP 降解物的测定 水产动物死后肌体内ATP 一般按以下顺序分解：ATP →二磷酸腺苷(adenosine diphosphate,ADP)→一磷酸腺苷(adenosine monophosphate,AMP)→肌苷酸(inosinemonphosphate,IMP)→肌苷(inosine,HxR)→次黄嘌呤(hypoxanthine,Hx)→尿酸(uric acid,UA)。其中,次黄嘌呤能在黄嘌呤氧化酶(xanthine oxidase,XOD)的作用下生成黄嘌呤(xanthine),而后生成尿酸,具体反应式如下：

研究发现,水产品中次黄嘌呤、黄嘌呤含量与挥发性盐基氮(volatile base nitrogen,TVB-N)值和细菌菌落总数之间呈现良好的相关性[19-20],可以用来表征鱼类等水产品的新鲜度。基于此理论目前已开发多种电极上耦合有XOD 的电化学生物传感器,通过测定XOD催化反应产生的过氧化氢浓度来测定次黄嘌呤或黄嘌呤的含量,从而实现水产品新鲜度的检测。Lawal等[21]以聚吡咯膜包裹的铂电极作为XOD 的固定载体,设计了两款检测水产品中次黄嘌呤含量的电位型和电流型生物传感器并比较其性能,结果显示,电流型传感器的线性检测范围更宽,电位型传感器的检测灵敏度更高。Devi 等[22]为提高电流型传感器的检测性能,选择以氧化锌纳米粒子和聚吡咯复合物作为XOD的固定载体,得到了检测范围更宽(0～40 μmol·L-1),检测限更低(0.8 μmol·L-1)的黄嘌呤生物传感器,并且有效地提高了传感器的使用寿命,经过研究发现,传感器测定的结果与酶比色法测定的结果之间呈现良好的相关性,相关系数为0.93,此外还验证了黄嘌呤含量可指示鱼体的新鲜度。Agüí 等[23]以电沉积金纳米颗粒为XOD 的固定载体设计了一款电流型生物传感器,不仅能大幅度减少电活性物质如抗坏血酸等对检测的影响,而且能够提高酶的稳定性,为解决传统酶传感器易受干扰,检测结果不准确的问题提供了新思路。耦合有XOD 的电化学传感器的新鲜度检测以过氧化氢为媒介,但直接检测过氧化氢需要在高于0.3 Ⅴ的电位下操作,水产品中的电活性物质会对检测有干扰。Shan 等[24]利用辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase,HRP)催化过氧化氢分解以降低检测过程中的操作电位,并以碳酸钙纳米材料为载体固定HRP和XOD,能够显著提高酶的稳定性和催化活性,减少电活性物质对检测的干扰,并进一步提高电化学酶传感器应用于水产品新鲜度检测的准确度。

3.1.2 生物胺的测定 生物胺是蛋白质降解过程中通过游离氨基酸脱羧产生的简单含氮化合物,在食品中常见的有组胺、腐胺、尸胺、酪胺、β-苯基乙胺、精胺和亚精胺等。适量的生物胺有利于生物体的正常生理活动,但其过量积累会导致人体产生不良反应,其中,组胺的毒性最大[25]。肉制品中高含量的生物胺,尤其是组胺、腐胺、尸胺和酪胺等,与细菌的降解有关,因此,其组成和含量可以反映肉制品的腐败变质程度[26-27]。郭慧[28]研究了不同海洋鱼类生物胺变化与TVB-N 之间的相关性,得出小黄鱼特征生物胺为腐胺、尸胺、组胺、酪胺,带鱼特征生物胺为腐胺、尸胺、酪胺,米鱼特征生物胺为腐胺、尸胺。可见,不同水产品与其新鲜度关联的特征生物胺存在差异,这就对生物传感器的构建提出了挑战。

Bóka 等[29]设计了3 种电流型酶传感器,分析不同胺氧化酶构建的生物传感器快速检测水产品中多种生物胺含量的可行性；研究了固定二胺氧化酶/HRP的传感器用于检测总生物胺的含量,固定单胺氧化酶/HRP 的传感器用于检测酪胺、色胺和苯乙胺的含量,固定腐胺氧化酶/HRP 的传感器用于检测腐胺的含量。结果显示,基于单胺氧化酶的传感器不适用于肉类新鲜度的测定,其余2 种传感器可以有效地检测水产品中生物胺的含量。Keow 等[30]用甲基丙烯酸二羟甲基酯的水凝胶膜固定二胺氧化酶,设计了一种电流型生物传感器用于测定斑节对虾中的组胺含量,这种传感器重复性好,且与常规高效液相色谱法测定结果具有良好的相关性。

3.2 微生物传感器

微生物传感器是由固定化微生物细胞与具有信号转换功能的介质结合而成的生物传感器,一些主要的微生物传感器依据微生物的呼吸或代谢作用产生电流、电压、电导的变化达到测定的目的[31-32]。Hoshi等[33]以腐败酵母(Alteromonas putrefaciens)为生物识别元件制备了微生物传感系统,用于蓝鳍金枪鱼表面氨基酸含量的测定,结果发现鱼肉的新鲜度与传感器的响应值具有良好的相关性。由于生物识别元件即微生物细胞的选择较为单一,制约了微生物传感器的进一步发展[34],近年来后续的研究报道相对较少。

4 水产品新鲜度检测用生物传感器最新研究成果

生物传感器要真正应用于水产品新鲜度的检测,必须解决两个问题：一是要简化检测前的预处理过程；二是要提高生物传感器的选择性和灵敏度等性能,降低传感器的成本或提高重复利用率。目前的研究重点在于突破现有传感器在灵敏度、检测范围和重复使用率方面的瓶颈,随着相关研究的不断深入,在信号转化器方面的研究基本成熟,想要实现这个目的就需要对酶等生物识别元件进行优化升级。纳米材料的快速发展为生物传感器的研究和应用提供了新的契机,尤其为XOD 或各种胺氧化酶固定载体的优化设计以及新型传感器的构建提供了更多可能。

4.1 酶固定载体

天然酶存在易变性、不能反复利用、催化反应不可控的缺点。因此,在设计酶生物传感器时需要对酶进行固定,解决游离态酶带来的问题。固定载体的材料大致可以分为三类,即传统膜材料、导电高分子和纳米材料。传统膜材料主要包括Nafion 膜、磷脂膜、醋酸纤维素膜和聚氯乙烯膜等,这些传统膜载体存在稳定性差、易碎、弹性差的缺点,影响其在传感器领域的发展[22]。高分子材料作为酶固定载体相对而言测定速度更快、灵敏度更高,但也存在着吸附酶量过少的问题[35]。纳米材料具有量子尺寸效应、表面效应、小尺寸效应和宏观量子隧道效应等独特的物理化学特性,作为固定载体可提高酶的催化效率、稳定性,具有较大的比表面积可提高固定酶量,还能减少被测物质的特异性吸附,提高传感器的灵敏度,扩大检测范围[36]。固定载体作为酶传感器的重要组成部分,其结构和性能直接影响酶催化活性、稳定性,以及传感器的重复使用率和灵敏度[37]。因此,近年来对应用于水产品新鲜度检测的生物传感器的酶固定载体的研究和报道层出不穷。

表2 统计了近5年基于不同酶固定载体的电化学生物传感器在水产品新鲜度检测方面的代表性研究。可以发现,近年来大部分研究采用复合材料作为XOD和各种胺氧化酶的固定载体,其中高分子材料和纳米材料的复合或多种纳米材料的复合是此类传感器酶固定载体发展的趋势。原因在于：一方面多种材料复合可互相弥补缺陷,如用纳米材料和壳聚糖复合来解决壳聚糖导电性差的问题[38]；另一方面通过多种材料的复合强化载体材料的性能,能够获得最佳的工作性能,如用多壁碳纳米管(multi-walled carbon nanotube,MWCNT)和二氧化钛(TiO2)纳米材料复合来改变工作电极,使其具有优异的稳定性、再现性和灵敏度[39]。通过不同材料在性能上的取长补短、协同效应,使复合材料的综合性能优于原组成材料并能够满足不同的要求,令复合材料大量应用于传感器的构建。下面列举几种典型的酶固定载体材料及其复合材料在水产品新鲜度检测用传感器方面的研究进展。

壳聚糖,一种天然高分子材料,具有良好的可降解性、生物相容性和优异的成膜能力。壳聚糖的羟基和氨基官能团可以与生物活性分子反应用作酶共价固定的底物,是最常用来固定酶的高分子材料,但是壳聚糖的导电性能较差,以其为固定载体的传感器,电子信号传递存在一定的问题[38]。利用多种材料修饰壳聚糖可改善其固定酶的弊端,如羧化多壁碳纳米管[40]、珍珠状氧化锰纳米材料[41]、氧化钴纳米材料[42]等。其中Dervisevic 等[38]提出用金纳米颗粒和聚吡咯修饰的壳聚糖作为XOD 的固定载体,凭借金纳米颗粒优异的生物相容性和导电性显著提高了酶的稳定性以及传感器的电子传递能力,所设计的黄嘌呤生物传感器检测范围(1～200 μmol·L-1)更广、灵敏度(1.4 nA·μmol·L-1)更高,更适用于水产品新鲜度的检测,但是在抗干扰能力、响应时间方面还有待加强。

金属及金属氧化物纳米材料,是一类具有独特物理和化学性质的物质,具有优秀的传质、传热、催化、导电性能且存在大量吸收抗体、酶和抗原的位点[43],其中在酶固定载体方面应用较多的是金、银、TiO2以及一些多孔金属氧化物纳米材料等。金纳米颗粒具有高化学稳定性,出色的催化活性和其他显著特性,能与多种生物大分子结合且不影响其生物活性,因此研究广泛[44]；多孔金属氧化物具备的孔洞结构能够保证纳米金属氧化物性能的均一性和稳定性[45]。Kant 等[46]用三氧化二钽作为XOD 固定载体设计的黄嘌呤生物传感器除了在检测限、酶稳定性方面有优异表现外,在检测范围、灵敏度方面的表现较差,因此,金属及金属氧化物一般不单独作为酶固定载体。

由于壳聚糖本身存在的问题限制了其成为理想的酶固定载体,研究人员将目光转向了碳基纳米材料。石墨烯是目前最具有前景的新型材料,相对于壳聚糖,其可以显著提高水产品新鲜度检测生物传感器的性能,更适合作为酶的固定载体。石墨烯是由碳原子以六边形排列组成的二维纳米材料,具有优异的导热性和导电性、高电子迁移率、较高的酶负载能力等特点[47]。但是石墨烯形成的胶体稳定性差,固定在石墨烯上的蛋白不稳定,容易被洗脱,因此石墨烯一般和其他材料聚合使用。Albelda 等[48]利用TiO2修饰石墨烯,能够显著提高石墨烯对蛋白质的吸附能力,可以有效防止XOD 被洗脱,并且表现出了极宽的次黄嘌呤检测范围(20～512 μmol·L-1),与标准酶比色法测定的水产品中次黄嘌呤含量相关性良好,相关系数r＝0.979 5。但如何提高石墨烯作为固定载体的酶传感器的检测限、灵敏度是亟待解决的问题。

碳纳米管也是一种优质的碳基纳米材料,具有可变的导电性,可与不同化学基团共价或者非共价结合,特别是碳纳米管与胺和羧基等官能团结合能够增加传感器电子转移的速率。碳纳米管是研究和应用最为广泛的酶固定载体材料之一,包括多壁和单壁碳纳米管[47]。Narang 等[39]设计了一款基于XOD 的黄嘌呤电化学传感器,以碳纳米管和TiO2纳米复合材料作为XOD 的固定载体,通过2 种物质的协同作用提升传感器的性能,在酶的稳定性(60 d 内活性只降低40%)、传感器的检测范围(0.5～500 μmol·L-1)等方面均有较大的提升,且抗干扰能力优异,是目前性能最好的检测水产品新鲜度的生物传感器之一,但是该传感器响应时间较长、灵敏度较低,限制了其在市场检测中的应用。

表2 基于不同酶固定载体的电化学生物传感器应用于水产品新鲜度检测Table 2 Electrochemical biosensors with different enzyme immobilization carriers for freshness of aquatic products

表2(续)

4.2 新型纳米传感器

纳米材料除作为酶固定载体外,还可使生物传感器朝着多元化的方向发展,如纳米材料优秀的催化性能使其能够代替酶,又如金纳米棒和银纳米棒[61]等纳米材料吸收波长可随尺寸变化而调控,由此建立的各种光学检测方法已成为生物传感器研究热点之一。此外,组胺抗体等生物敏感材料也可作为酶的替代物,应用于水产品新鲜度的检测。下面介绍几种新型的纳米生物传感器在水产品新鲜度检测中的最新研究应用。

Hu 等[62]设计了一种新型的光学生物传感器用于次黄嘌呤的检测,鱼样经过一定的预处理后,先用XOD 催化鱼样中的次黄嘌呤产生过氧化氢,然后加入邻苯二胺和可作为过氧化物酶相似物、具有荧光特性的氨基功能化金属有机骨架(NH2-Cu-MOF)纳米片,以NH2-Cu-MOF 催化过氧化氢产生的羟基自由基来氧化邻苯二胺为邻苯二甲酸二烯丙酯,可以猝灭NH2-Cu-MOF 的荧光效应,荧光的强度与次黄嘌呤的浓度成反比,基于这个原理可实现对次黄嘌呤含量的检测此传感器对次黄嘌呤的检测范围为10～2 000 μmol·L-1,具有高灵敏度和高选择性,在食品分析检测次黄嘌呤和水产品新鲜度方面具有巨大前景。

Chen 等[63]设计了一款测定水产品新鲜度的多彩比色生物传感器。在XOD 作用下次黄嘌呤被分解产生过氧化氢,而后过氧化氢通过Fe2＋诱导蚀刻金纳米棒形成不同尺寸,由于金纳米棒局域表面等离子体共振的作用导致传感系统颜色丰富多彩的变化,从而实现以肉眼观察直接半定量检测次黄嘌呤浓度的目的。该传感器的检测范围为0.05～0.63 mmol·L-1,能够通过肉眼观察系统的颜色评估鱼的新鲜度,以光学可视化方法替代电化学电极等设备,为未来该领域传感器的发展提供了新的方向。

Ye 等[64]设计了一种用于水产品中组胺检测的电化学阻抗免疫传感器。将组胺抗体固定在纳米多孔氧化铝膜上,组胺存在条件下纳米氧化铝膜上会发生免疫反应导致传感器阻抗响应,阻抗的变化与组胺的含量呈现良好的正相关性。这是一种具有高灵敏度、高特异性的传感体系。此外,用抗体替代稳定性较差的酶作为生物识别元件,也为水产品新鲜度快速检测用生物传感器的制作提供了一种新的思路。

5 结论与展望

综上,生物传感器凭借其高效、操作简单、对环境友好以及可直接检测水产品腐败引起的化学成分变化等优势在水产品新鲜度检测用方面受到了广泛关注。纳米材料是目前水产品新鲜度检测用生物传感器的研究热点,因其强化了传感器的性能,拓展了新鲜度检测生物传感器的类型。但是目前所设计的水产品新鲜度检测用生物传感器在检测范围、灵敏度、抗干扰能力、重现性、造价或重复使用率等方面仍存在一定的不足。随着新型纳米材料的不断发现以及测试技术、微流控技术、纸基芯片和人工智能等技术的不断突破,生物传感器将进一步发展,走出实验室,真正应用于市场。

当前生物传感器已经能够实现次黄嘌呤、黄嘌呤、尿酸、组胺、腐胺等物质的快速检测,针对不同的水产品建立相应的数学模型,并通过模型有效判断新鲜度也是未来水产品新鲜度评估研究的一个前进方向。此外,多检测指标的融合必然更加贴合水产品实际新鲜度检测和渔业生产需求,也是水产品新鲜度检测用生物传感器的发展趋势。