鼠巨细胞病毒升高血压并引起血管平滑肌的增殖重塑

黄桢，石运忠，唐娜，陈璋玥，徐浩文，汤利，常红霞，李凯芳，何芳

(石河子大学医学院，新疆 石河子 832000)

高血压是一种常见的、慢性的、与年龄有关的疾病，是导致心血管并发症的一种常见病、多发病[1]，目前已成为最严重和最昂贵的公共卫生问题。大约95%的高血压患者为原发性高血压(Essential Hypertension，EH)；但到目前为止，原发性高血压的确切病因与发病机制仍未阐明[2]。其可能的病理生理学机制为原发性或继发性的钠分泌失调[3]，中枢神经系统[4]、内分泌因子[5]、大动脉和微循环[6]等因素也参与了疾病的发生。最近的一项研究显示，人巨细胞病毒感染可引起动脉血压升高[7]。

血管平滑肌细胞(Vascular smooth muscle cells，VSMC)是血管壁的主要细胞成分之一，它们以分化的收缩表型为主，并以此来维持血管张力[8]，其主要功能是通过收缩血管，从而调节血流量和血压。血管平滑肌细胞的分化和增殖是血管发育过程中的两个重要生理过程，主动脉平滑肌细胞并不是终末分化细胞，在遇到刺激(如血压升高)时，能够从分化的(收缩)表型转换成去分化的(合成)表型[9]，这种表型转换是高血压主动脉血管重塑过程中的主要病理生理过程[10]。在本研究中，我们通过鼠巨细胞病毒(Murine cytomegalovirus，MCMV)腹腔感染C57BL/6 J小鼠，从病毒病因学角度部分阐明MCMV在高血压及血管重塑中的作用和机制，并为临床高血压防治提供新思路。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

主要材料：7月龄雄性C57BL/6 J小鼠，购自北京维通利华实验动物有限责任公司(许可证编号SCXK京2016-0006)；MCMV由湖北武汉病毒研究所神经病毒学科惠赠；伊红染液及苏木素染液购自江苏碧云天生物有限公司；Masson染色试剂盒购自北京索莱宝科技有限公司；戊巴比妥钠购自上海信裕生物科技有限公司；Western Blot制胶液购自购自北京索莱宝科技有限公司；α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、细胞增殖核抗原(PCNA)、β-actin抗体购自武汉博士德生物工程有限公司；骨桥蛋白(OPN)抗体购自美国Abcam公司；PCR引物购自上海生工生物工程有限公司；DNA提取试剂盒购自北京天根生化科技有限公司；异丙醇、无水乙醇购自天津市致远化学试剂有限公司。

主要仪器：低温超速离心机(Thermo公司，美国)；PCR核酸扩增仪(Takara公司，日本)；显微镜(奥林巴斯IX73，中国)；高精度凝胶成像分析系统(Bio-Rad公司，美国)；电泳仪(Bio-Rad公司，美国)；转膜仪(Bio-Rad公司，美国)；BL-420F有创测压装置(成都泰盟公司，中国)。

1.2 MCMV感染小鼠疾病模型

7月龄雄性C57BL/6 J小鼠60只，适应性饲养7 d后随机分为MCMV感染组和生理盐水对照组。感染组腹腔注射MCMV(105pfu/mL)，对照组注射等量生理盐水。之后每周按上述剂量持续干预。

1.3 有创血压监测

使用戊巴比妥钠(40 mg/kg)腹腔注射麻醉小鼠。麻醉成功后，颈部皮肤备皮，颈部正中切开，然后快速分离左颈总动脉，远心端结扎，近心端用动脉夹夹住，用正压留置针在靠近远心端处进针，固定留置针将针芯拔出，细软管便可固定于动脉中，连接测压装置，即可测压。通过测量各组小鼠颈动脉收缩压(systolic blood pressure,SBP)、舒张压(diastolic blood pressure,DBP)，计算平均动脉压(mean arterial pressure,MAP)(MAP=DBP+1/3(SBP-DBP))。每组小鼠随机选取5只并记录。

1.4 DNA提取与PCR扩增鉴定

使用血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒提取血管组织悬液中的DNA，利用PCR试剂盒进行检测MCMV IE DNA的表达。引物序列如表1所示。

表1 PCR引物序列

1.5 HE染色

组织置于pH7.0的4%多聚甲醛缓冲液中，室温下固定24 h。组织包埋，切片(4 μm)，选用伊红-苏木素染色，光镜观察。随机选取每个组织的5个显微镜场(×400放大率)，计算血管壁厚度。

1.6 Masson染色

组织置于pH7.0的4%多聚甲醛缓冲液中，室温下固定24 h。组织包埋，切片(4 μm)，用Masson染色，光镜观察。随机选取每个组织的5个显微镜场(×400放大率)，计算胶原面积占视野面积百分比。

1.7 Western Blot

收集前期留取的胸主动脉，在液氮中将组织研磨至匀浆，用含有1%蛋白酶抑制剂溶液的裂解缓冲液提取蛋白质。将蛋白质在15%SDS-PAGE中电泳并转移至PVDF膜。在室温下用TBST中的5%脱脂奶粉封闭3 h后，将膜与以下一抗孵育:a-SMA(1∶400)，PCNA(1∶250)，OPN(1∶1000)，β-actin(1∶500)在4 ℃下过夜。用TBST洗涤后，将膜与辣根过氧化物酶标记的羊抗兔或羊抗鼠的二抗(1∶20 000)在室温下孵育2 h。使用软件定量Western Blot印迹条带，结果用Image J软件量化，重复测量3次取其平均值。

1.8 统计分析

2 结果

2.1 MCMV成功感染C57BL/6 J小鼠胸主动脉

为了证实MCMV成功感染C57BL/6 J小鼠胸主动脉，在MCMV腹腔感染2月后(9月龄)，我们处死了部分小鼠，提取小鼠胸主动脉DNA，使用PCR进行病毒DNA扩增。PCR结果可见MCMV 即刻早起基因(IE)DNA产物(700 bp)，可反映感染成功(图1)。

图1 胸主动脉组织MCMV IE DNA检测

2.2 MCMV感染对C57BL/6 J小鼠血压的影响

有创血压监测结果显示：与同月龄对照组相比，MCMV干预至9月龄时，MCMV组小鼠SBP、DBP和MAP均较对照组明显升高；且随MCMV感染时间延长(至13月龄)，SBP、DBP和MAP升高更明显(表2、表3、表4、图2)。

表2 各组小鼠收缩期血压(SBP)比较

注：*P<0.05，MCMV组与同月龄对照组相比。**P<0.05，MCMV 9月龄组与MCMV 7月龄组相比。

表3 各组小鼠舒张期血压(DBP)比较

注：*P<0.05，MCMV组与同月龄对照组相比。**P<0.05，MCMV 9月龄组与MCMV 7月龄组相比。

表4 各组小鼠平均动脉血压(MBP)比较

注：*P<0.05，MCMV组与同月龄对照组相比。**P<0.05，MCMV 9月龄组与MCMV 7月龄组相比。

*P<0.05，MCMV组与同月龄对照组相比。**P<0.05，MCMV 9月龄组与MCMV 7月龄组相比。图2 MCMV感染对小鼠血压的影响

2.3 MCMV感染对C57BL/6 J小鼠胸主动脉形态学的影响

HE染色显示MCMV干预至9月龄时，小鼠胸主动脉形态大致正常，表现为胸主动脉结构排列规整，界限清晰。血管内膜光滑，中膜无增厚且弹性纤维呈同心圆排列；在MCMV干预至12月龄时，与同月龄对照组相比，胸主动脉开始出现明显的血管重构现象，表现为血管内膜欠光滑，中膜平滑肌细胞层数增加、细胞核数量增多且排列紊乱，同时出现分层不清、排列紊乱、厚薄不均的现象(表5、图3A、图3B)。Masson染色观察小鼠动脉血管胶原纤维沉积。结果显示，胶原纤维呈蓝色，细胞质、肌纤维呈红色，细胞核呈蓝褐色(图3C)。使用Image-Pro Plus6.0软件测量胶原面积占血管总面积的百分比(CA%)。结果显示，在MCMV干预至12月龄时，MCMV组小鼠中膜CA%明显增加(表6、图3C、图3D)。

表5 各组中不同月份中膜厚度比较

注：*P<0.05，MCMV组与同月龄对照组相比。

表6 各组小鼠主动脉血管纤维化面积比值比较

注：*P<0.05，MCMV组与同月龄对照组相比。

图3 MCMV感染对小鼠胸主动脉形态学影响

2.4 MCMV感染对小鼠主动脉重塑蛋白的影响

Western blot结果显示：在MCMV干预至12月龄时，与对照组相比，MCMV组小鼠胸主动脉α-SMA表达减少，OPN、PCNA表达增加(图4A、图4B)。

图4 MCMV感染对小鼠胸主动脉重塑蛋白影响

3 讨论

MCMV是一种天然小鼠病原体，它在感染其生物宿主后提供了一种独特的模型来研究体内医学上重要的病毒。实际上，巨细胞病毒(cytomegalovirus，CMV)感染的临床前小鼠模型为同种异体造血干细胞或骨髓移植的免疫生物学提供了有价值的见解，且几种模型被用来研究眼内CMV感染的病因和发病机理，包括体内神经视网膜，这些主要依赖于眼内注射病毒[11]，血液-视网膜屏障被破坏的小鼠感染[12]，或严重免疫抑制小鼠的感染[13]，CMV全身感染[14]，从这些模型中获得的大部分信息已经转化为临床实践[15]。本研究中，我们使用MCMV腹腔注射感染C57BL/6 J小鼠建立模型。在感染至9月龄时，取小鼠的胸主动脉，通过PCR进行MCMV特异性IE DNA序列验证，凝胶电泳结果显示扩增出700 bp产物，表明MCMV感染成功。

2011年，我国学者在国际上首次提出高血压病毒感染学说，认为人巨细胞病毒(HCMV)及其编码的microRNA与原发性高血压相关[16]，并且在中国患者中，HCMV感染与EH之间存在显着相关性，而在其他种族之间则没有相关性[17]。而在我们的实验中，MCMV干预至9月龄时，MCMV组小鼠SBP、DBP和MAP均较对照组明显升高，这与Cheng J等[7]的研究结果一致；且随MCMV感染时间延长，SBP、DBP和MAP升高更明显，提示MCMV感染引起的血压升高具有时间依赖性。

血管重塑主要和四种类型的细胞相关：外膜层中的成纤维细胞、内侧层中的平滑肌细胞、内膜层中的内皮细胞和血流中的巨噬细胞[18]。其形态学主要表现为中膜层的增厚，管壁硬化增加和血管顺应性的降低[19]。我们的研究发现MCMV感染至12月龄时出现了胸主动脉中膜厚度增加、胶原纤维沉积等血管重塑的典型表现；同时Western blot结果显示血管平滑肌收缩表型蛋白α-SMA表达减少，合成表型蛋白OPN、PCNA表达增加，说明MCMV感染引起小鼠血压持续升高后，动脉血管中膜VSMC由收缩表型逐渐向合成表型转化，引发了血管平滑肌增殖重塑。

遗憾的是，本实验仅研究MCMV感染对胸主动脉的影响，并未关注肠系膜动脉等中小动脉，虽然已有大量的文献表明，中小动脉的结构改变或重塑是高血压的标志[20-21]，但也有文献表明，高血压在引起中小动脉重构的同时，也影响胸主动脉的重构[22]，并且胸主动脉还具有易取材、组织丰富、代表性强等优势。综上所述，本研究表明，MCMV感染通过引起C57BL/6 J小鼠血压持续性升高，进而导致胸主动脉血管平滑肌增殖重塑。因此，控制CMV感染可能成为临床预防高血压的新策略。